一、服务概况

嘉美生物化合物Pull-down（小分子Pull-down）是一种基于亲和纯化的体外技术，用于筛选和鉴定与特定小分子化合物（药物、天然产物、化学探针等）特异性结合的靶点蛋白。该技术将小分子化合物作为“诱饵”，从复杂蛋白混合物（如细胞裂解液）中“钓取”与其相互作用的“猎物”蛋白。

根据检测目的不同，主要分为两种服务路线：

1.WB验证型：验证已知候选蛋白是否与化合物结合

2.质谱（MS）筛选型：高通量鉴定与化合物结合的未知靶蛋白

二、技术原理

化合物Pull-down的核心是基于生物素-链霉亲和素的高亲和力系统。根据小分子标记方式的不同，主要分为两种技术路线：

1.体外标记法（直接法）：在体外将小分子化合物进行生物素（Biotin）修饰。生物素化的小分子与蛋白裂解液充分孵育后，加入链霉亲和素（Streptavidin, SA）标记的磁珠。SA磁珠特异性捕获生物素分子，从而将与化合物结合的蛋白一同纯化出来。

2.生物正交法（点击化学法）：将小分子化合物进行炔烃修饰，添加至细胞或组织中与靶蛋白充分结合。提取蛋白后，通过点击化学反应（Click Chemistry） 将叠氮生物素与小分子连接，再通过SA磁珠进行富集。该方法更接近生理状态，适用于弱/瞬时相互作用及膜蛋白研究。

3.光交联法：对药物小分子修饰光交联基团，与蛋白孵育后进行UV照射使小分子与靶蛋白共价连接，再通过点击化学反应使小分子生物素化并富集。

三、服务流程与技术路线

① 小分子修饰与探针制备：根据化合物结构设计生物素化或炔基化修饰方案；评估标记策略与成功率

② 蛋白样品制备：裂解细胞/组织提取总蛋白；部分项目分离特定细胞器蛋白（核蛋白、线粒体蛋白等）

③ 孵育与结合：生物素化小分子与蛋白裂解液充分孵育，形成化合物-蛋白复合物

④ 磁珠富集：加入链霉亲和素磁珠，特异性捕获生物素标记的复合物

⑤ 洗涤：梯度洗涤去除非特异性结合的杂蛋白

⑥ 洗脱与检测：洗脱蛋白复合物；WB验证已知蛋白 / SDS-PAGE银染后质谱鉴定未知蛋白

四、服务说明与样本要求

1.小分子化合物：提供化合物结构式、分子量、溶解性等信息；嘉美生物评估生物素修饰策略和成功率

2.细胞样本：冻存细胞或培养细胞，建议≥1×10⁷个/组

3.组织样本：动物或植物组织，建议≥500 mg

4.蛋白样本：总蛋白量建议≥1 mg；全程4℃以下冰上操作，添加蛋白酶抑制剂防止降解

5.抗体（WB检测）：如做WB验证，需提供特异性一抗及说明书

6.对照设置：必须设置溶剂对照组（如DMSO）、非标记小分子对照组或游离生物素对照组

7.保存运输：样本液氮速冻后-80℃保存，干冰运输

五、交付内容

1.小分子生物素化修饰产物及质控报告

2.Pull-down产物的SDS-PAGE银染图

3.Western Blot检测图（验证型）或质谱鉴定报告（筛选型）

4.质谱原始数据及互作蛋白列表（含可信度评分）

5.生物信息学分析结果（GO注释、KEGG通路富集等）

6.完整实验报告（含材料与方法、原始数据、结果分析等）

六、应用领域

1.药物靶点发现（Target Deconvolution）：鉴定小分子药物、天然产物的直接作用靶点蛋白

2.先导化合物筛选：快速发现全新结构的先导化合物并了解其靶点选择性

3.药物作用机制研究：阐明药物通过哪些靶蛋白发挥药理作用

4.老药新用：发现已知药物的新靶点，拓展适应症

5.中药活性成分研究：鉴定中药单体成分的靶点蛋白

6.PROTAC/分子胶研究：验证降解剂与靶蛋白及E3连接酶的结合

7.化合物脱靶效应评估：评估药物与非预期靶点的结合，预测副作用

七、常见问题（FAQ）

Q1：哪些小分子适合做Pull-down？

A：绝大多数小分子化合物均可尝试，但需要可进行化学修饰（生物素化或炔基化）。结构简单的化合物可直接反应，结构复杂的可能需要衍生化后修饰。建议将化合物结构式发给嘉美生物评估修饰策略和成功率。

Q2：体外标记法与生物正交法如何选择？

A：体外标记法操作简便、成本较低，但生物素修饰可能改变小分子原有活性。生物正交法（点击化学）在活细胞/动物体内进行标记，更接近生理状态，能捕获弱/瞬时相互作用。若化合物难以直接生物素化，或研究弱相互作用，推荐生物正交法。

Q3：如何设置阴性对照？

A：常用三种对照策略：①溶剂对照组（如DMSO，不含化合物）；②非标记小分子对照组（等量未生物素化的原化合物）；③游离生物素对照组。三组平行实验，用于排除磁珠、生物素及溶剂造成的非特异性结合。

Q4：Pull-down后银染没有目的条带或信号很弱，是什么原因？

A：可能原因及解决方案：①样品被蛋白酶降解——全程4℃以下操作，添加足量蛋白酶抑制剂；②小分子与蛋白结合较弱——考虑采用光交联法共价固定相互作用；③生物素化小分子量不足或活性丧失——增加探针用量或重新制备；④细胞裂解量不足——增加起始样本量。

Q5：Pull-down后出现大量非特异性蛋白（背景高），怎么处理？

A：非特异性结合是小分子Pull-down最常见的问题。解决方案：①优化洗涤条件——增加洗涤次数或提高洗涤严谨度；②设置严格的阴性对照排除背景；③采用竞争性洗脱验证结合特异性；④适当降低孵育体系中蛋白浓度或缩短孵育时间。

Q6：小分子生物素化后活性可能改变，如何评估？

A：生物素修饰可能影响小分子的原有功能。建议：①通过细胞活性实验（如CCK-8）比较修饰前后化合物的活性变化；②若活性显著下降，可尝试更换生物素修饰位点（避开关键活性基团）；③或采用生物正交法（点击化学），避免直接修饰影响活性。

Q7：Pull-down后如何验证找到的靶蛋白是真的？

A：验证策略包括：①竞争实验——加入过量非生物素化原化合物进行竞争洗脱，若靶蛋白信号减弱则验证特异性；②MST/SPR——在纯蛋白水平验证化合物与靶蛋白的结合亲和力；③细胞热位移分析（CETSA） ——验证化合物在细胞内与靶蛋白的结合；④敲低/过表达——验证靶蛋白在细胞功能实验中是否介导化合物的表型效应。