一、服务概况

嘉美生物RNA pull-down是体外检测RNA与其结合蛋白（RBP）相互作用的核心技术之一。该技术利用生物素标记的目的RNA作为诱饵，与细胞蛋白提取液孵育后形成RNA-蛋白质复合物，再通过链霉亲和素磁珠分离复合物。分离后的产物可通过Western Blot验证已知互作蛋白，或通过质谱（MS）筛选未知互作蛋白。该服务广泛适用于lncRNA、circRNA、miRNA等非编码RNA的结合蛋白研究。

二、技术原理

体外转录法制备生物素标记的RNA探针，与细胞裂解液（胞浆/胞核/全蛋白）共同孵育。RNA探针与细胞中的结合蛋白形成RNA-蛋白质复合物。复合物与链霉亲和素标记的磁珠结合，经磁性分离从孵育液中分离出来。复合物洗脱后，通过WB或质谱对捕获的蛋白进行鉴定。

三、服务流程与技术路线

1.方案制定：根据研究目的确定实验方案

2.探针制备：DNA序列T克隆 → 体外转录合成生物素标记RNA探针

3.Pull-down实验：RNA探针与细胞蛋白提取液孵育 → 与链霉亲和素磁珠结合 → 洗脱

4.产物检测：SDS-PAGE银染评估蛋白含量 → WB验证已知蛋白 / 质谱鉴定未知蛋白

5.数据分析与交付

四、服务说明与样本要求

1.基因信息：提供目的RNA的物种、序列或GenBank登录号

2.细胞样本：活细胞量一般需3×10⁷ ~ 5×10⁸个

3.组织样本：建议≥100 mg（动物）或≥5 g（植物）

4.抗体：如做WB验证，需提供目的蛋白抗体

5.运输保存：样本液氮速冻后-80℃保存，干冰运输

6.对照设置：必须设置反义链对照组（探针法）或无RNA磁珠对照组

五、交付内容

1.含目的基因的质粒、菌液及测序报告

2.体外转录模板及探针电泳图

3.RNA Pull-down产物SDS-PAGE银染图

4.Western Blot检测图或质谱鉴定报告

5.生物信息学分析结果（GO、KEGG、String等）

6.完整实验报告

六、应用领域

1.非编码RNA机制研究：lncRNA、circRNA、miRNA与蛋白互作解析

2.已知互作验证：验证特定RNA与候选蛋白是否存在物理结合

3.未知互作蛋白筛选：通过RNA pull-down + MS发现新互作蛋白

4.RNA修饰研究：鉴定与RNA修饰酶相互作用的蛋白

5.疾病机制研究：探索RNA与疾病相关蛋白的相互作用

七、常见问题（FAQ）

Q1：RNA pull-down实验必须设置哪些对照？

A：必须设置反义链对照组（正义链孵育组 vs 反义链孵育组）；另外建议设置无RNA磁珠对照组，排除磁珠和裂解液成分的非特异性结合。

Q2：如何防止RNA降解？

A：RNA本身易降解，全程需严防RNase污染。所有耗材需灭菌，试剂用DEPC水配制；操作台用RNaseZAP擦拭；处理后的耗材应在两周内使用。

Q3：RNA结合蛋白没有结合或亲和力不够怎么办？

A：可能原因：靶蛋白量不足、缓冲体系不当、亲和力本身较低。解决方案：增加上样蛋白量、采用低盐体系、加入交联试剂；优化孵育时间、温度和盐浓度等条件。

Q4：RNA pull-down后银染条带背景深或模糊是什么原因？

A：背景深可能因SDS-PAGE染色时间过长、抗体质量问题或非特异性蛋白过多。条带浅且模糊可能因互作蛋白表达量低或样本量不足。建议优化孵育条件和缓冲体系、提高裂解液质量，或增加起始样本量。

Q5：WB检测时信噪比高怎么处理？

A：可能原因：阳性信号率低、一抗效率低、蛋白未充分溶解。解决方案：增加二抗用量、使用高灵敏度化学发光液、增加样品量。

Q6：RNA pull-down可以做circRNA吗？

A：可以，但前提是circRNA在细胞中表达丰度要高。

Q7：RNA pull-down的参考价格和周期是多少？

A：RNA pull-down WB服务价格约8,500-12,000元/样，周期5-6周；RNA pull-down MS服务价格约12,000-22,000元/样，周期8-9周。具体价格需根据序列长度、样本量等由嘉美生物评估确定。