一、服务概况
嘉美生物MicroRNA pull-down（miRNA pull-down）是研究miRNA与其靶标分子（mRNA、lncRNA、circRNA）及RNA结合蛋白（RBP）相互作用的核心技术。miRNA是一类长约21-23nt的内源性非编码RNA，通过与靶标RNA结合或与蛋白形成复合物，广泛参与基因表达调控、细胞周期、生物体发育等关键过程。
该服务主要分为两种检测路线：qPCR/WB验证型（验证已知靶标）和测序/质谱筛选型（高通量筛选未知靶标）。根据实验场景不同，又可分为体外法（裂解液孵育）和转染法（细胞内结合）两大类。
二、技术原理
miRNA pull-down的核心原理是利用生物素-链霉亲和素的高亲和力系统进行特异性捕获。
体外法：人工合成生物素标记的miRNA探针，将其结合到链霉亲和素磁珠上，再与细胞或组织裂解液孵育，捕获与miRNA结合的靶标分子。
转染法：将生物素标记的miRNA探针转染至活细胞中，探针在细胞内与靶标RNA或蛋白结合后，裂解细胞，再用链霉亲和素磁珠进行捕获与富集。
捕获的复合物经洗脱后，可通过qPCR/测序鉴定靶标RNA，或通过WB/质谱鉴定结合蛋白。
三、服务流程与技术路线
① 探针设计合成：根据目标miRNA序列，设计合成生物素标记的miRNA探针及阴性对照探针
② 样本准备：体外法，制备细胞/组织裂解液；转染法，将探针转染至细胞，培养36-48h
③ 复合物形成：将生物素化探针与裂解液（或转染后细胞裂解液）共孵育，形成miRNA-靶标复合物
④ 磁珠富集：加入链霉亲和素磁珠，捕获生物素标记的复合物，经磁性分离纯化
⑤ 洗脱与检测：洗脱复合物，通过qPCR/测序鉴定RNA靶标，或通过WB/质谱鉴定结合蛋白
四、服务说明与样本要求
1.客户提供：目标miRNA名称/序列/物种；细胞或组织样本；待测靶标信息（验证型）
2.细胞样本量：不低于3×10⁷个细胞；建议最好是5×10⁸个细胞
3.组织样本量：不低于500mg-1g
4.RNA样本量：IP后的RNA >1μg
5.保存运输：样品置于1.5mL EP管中，封口膜封好，干冰运输；-80℃保存，避免反复冻融
6.对照设置：必须设置阴性对照探针（如scramble RNA），排除非特异性结合
五、交付内容
1.生物素标记miRNA探针及阴性对照探针
2.Pull-down产物的SDS-PAGE银染图
3.Western Blot检测图（验证型）或质谱鉴定报告（筛选型）
4.qPCR/测序检测的靶标RNA列表（RNA靶标鉴定）
5.生物信息学分析结果（GO注释、KEGG通路富集等）
6.完整实验报告
六、应用领域
1.miRNA靶标鉴定：鉴定miRNA调控的靶基因（mRNA、lncRNA、circRNA）
2.miRNA-蛋白互作研究 筛选和验证与miRNA结合的RNA结合蛋白（RBP）
3.疾病机制研究：解析肿瘤、心血管疾病等中miRNA的调控网络
4.信号通路研究：探索miRNA在细胞增殖、分化、凋亡中的调控机制
5.表观遗传调控：研究miRNA介导的转录后调控及表观遗传修饰
七、常见问题（FAQ）
Q1：miRNA pull-down有哪几种实验方法？如何选择？
A：主要有三种方法：①生物素化miRNA pull-down——通过生物素标记的合成miRNA转染细胞，用链霉亲和素磁珠捕获，最常用；②LAMP法——用地高辛（DIG）标记pre-miRNA，用抗DIG抗体进行免疫共沉淀；③RIP法——用抗AGO2抗体免疫共沉淀RISC复合物。生物素化法操作简便、适用性最广。
Q2：体外法与转染法有什么区别？
A：体外法是将生物素化探针直接与细胞裂解液孵育，操作快捷，适合初步筛选；转染法是将探针转染至活细胞，让miRNA在天然细胞内环境中与靶标结合后再裂解捕获，更接近生理状态。建议根据实验目的选择：初步筛选可选体外法，验证生理性互作建议转染法。
Q3：如何设置阴性对照？
A：必须设置阴性对照探针（如scramble RNA或突变序列探针），与实验组探针平行进行pull-down实验。用于排除磁珠、裂解液成分的非特异性结合及背景干扰。
Q4：RNA结合蛋白没有结合或亲和力不够怎么办？
A：可能原因及解决方案：①靶蛋白量不足——增加上样蛋白量；②缓冲体系不当——优化孵育时间、温度、盐浓度；③亲和力低——加入交联试剂（如甲醛）稳定弱相互作用；④裂解不完全——增加裂解液用量。
Q5：如何防止RNA降解？
A：全程严防RNase污染：①所有耗材需灭菌，试剂用DEPC水配制；②操作台用RNaseZAP擦拭；③探针合成后电泳检测长度和浓度；④处理后的耗材需在两周内使用。
Q6：WB检测时信噪比高怎么处理？
A：可能原因及解决方案：①阳性信号率低——增加样品量；②一抗效率低——增加一抗用量或更换抗体；③蛋白未充分溶解——增加裂解液用量；④使用高灵敏度化学发光液增强信号。
Q7：实验周期和参考价格是多少？
A：miRNA pull-down qPCR/WB验证型服务周期约5-7周；pull-down + 质谱筛选型周期约8-9周。具体价格需根据序列长度、样本类型和嘉美生物评估确定。
