一、服务概况

lncRNA（长链非编码RNA）是一类长度超过200 nt的重要调控分子，其功能高度依赖与蛋白质的特异性相互作用。lncRNA通过结合转录因子、染色质修饰酶、RNA结合蛋白（RBP）等，广泛参与基因表达调控、细胞命运决定及疾病发生发展等关键生物学过程。深入解析lncRNA与蛋白质的互作网络，是揭示其功能机制的核心环节。

根据研究目的不同，lncRNA-蛋白互作服务主要分为以下技术路线：

1.lncRNA Pull-down + WB：Western Blot验证已知互作蛋白

2.lncRNA Pull-down + MS：质谱鉴定高通量筛选未知互作蛋白

3.RIP-qPCR 验证已知lncRNA靶标：qPCR

4.RIP-seq：高通量测序全基因组水平筛选lncRNA靶标

5.CHIRP-MS：质谱鉴定体内原位鉴定lncRNA结合蛋白

6.SILAC+lncRNA Pull-down：定量质谱定量筛选特异性互作蛋白

二、技术原理

1. RNA Pull-down（体外法）

该技术使用体外转录法制备生物素标记的lncRNA探针，与细胞或组织的蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。复合物与链霉亲和素标记的磁珠结合，经磁性分离后从孵育液中分离出来。复合物洗脱后，通过Western Blot验证已知蛋白，或通过质谱鉴定未知蛋白。该技术适用于从lncRNA出发研究其互作蛋白。

2. RIP（RNA结合蛋白免疫沉淀，体内法）

运用针对目标蛋白的特异性抗体，将相应的RNA-蛋白复合物从细胞裂解液中沉淀下来。经过分离纯化后，对结合在复合物上的RNA进行qPCR验证（RIP-qPCR）或高通量测序分析（RIP-seq）。该技术从蛋白出发，研究细胞内源性的RNA-蛋白互作。

3. CHIRP-MS（体内原位法）

生物样品在原位进行甲醛可逆交联，用生物素标记的RNA反义探针（预先固定）与靶标RNA杂交，富集结合的蛋白。通过强变性条件洗去非特异结合蛋白后，得到的RBP经LC-MS/MS鉴定和定量分析。该技术可反映细胞内真实互作状态，富集与靶标RNA原位结合的蛋白。

4. SILAC+lncRNA Pull-down（定量筛选法）

将SILAC（细胞培养条件下稳定同位素标记技术）与lncRNA Pull-down结合，通过轻/重同位素标记区分实验组与对照组，在质谱分析中直接比较，精准区分特异性互作蛋白与非特异性背景蛋白。

三、服务流程与技术路线

lncRNA Pull-down（以生物素探针法为例）：

① 探针设计与合成：针对目标lncRNA序列设计生物素标记探针

② 蛋白样品制备：制备细胞/组织蛋白提取液（核/浆/全蛋白）

③ 复合物形成：生物素探针与蛋白提取液共孵育

④ 磁珠富集：链霉亲和素磁珠捕获复合物

⑤ 洗涤与洗脱：去除非特异性结合蛋白，洗脱复合物

⑥ 下游检测：WB验证 / 质谱鉴定

RIP（以蛋白抗体法为例）：

① 细胞裂解：温和裂解，保留RNA-蛋白复合物

② 免疫沉淀：目标蛋白特异性抗体+Protein A/G磁珠孵育

③ 洗涤：去除非特异性结合的蛋白质和RNA

④ RNA纯化：从免疫复合物中提取纯化RNA

⑤ 检测分析：qPCR验证 / 高通量测序

四、服务说明与样本要求

1.客户提供：lncRNA Pull-down，lncRNA基因名称、序列、物种；RIP，细胞样本，目标蛋白特异性抗体（IP级别）及说明书

2.细胞样本量：lncRNA Pull-down，≥3×10⁷个/组；RIP，≥1×10⁷个/IP反应

3.组织样本量：lncRNA Pull-down，≥500 mg；RIP，≥100 mg

4.对照设置：lncRNA Pull-down，无探针对照 / 随机序列探针；RIP，IgG同型对照 + Input

5.保存运输：样本液氮速冻后-80℃保存，干冰运输

五、交付内容

1.lncRNA Pull-down产物的SDS-PAGE银染图

2.Western Blot检测图（验证型）或质谱鉴定报告（筛选型）

3.RIP-qPCR：目的RNA富集检测数据及标准Result Figure

4.RIP-seq：测序原始数据及生物信息学分析结果

5.生物信息学分析：GO功能注释、KEGG通路富集、蛋白互作网络构建等

6.完整实验报告（含材料与方法、原始数据等）

六、应用领域

1.lncRNA功能机制研究：解析lncRNA通过与哪些蛋白互作发挥生物学功能

2.未知互作蛋白筛选：发现lncRNA的新互作蛋白（转录因子、RBP、信号通路蛋白等）

3.已知互作验证：验证预测的lncRNA-蛋白互作关系

4.互作网络构建：构建lncRNA参与的分子调控网络

5.互作结构基础分析：定位lncRNA与蛋白互作的关键序列或结构域

6.疾病标志物筛选：筛选与疾病发生发展相关的差异结合蛋白

7.药物靶点发现：为疾病诊断、治疗和药物研发提供新靶点

七、常见问题（FAQ）

Q1：lncRNA Pull-down与RIP如何选择？

A：lncRNA Pull-down是从lncRNA出发“拉”蛋白（RNA为中心），适合已知lncRNA、需要筛选或验证其互作蛋白的场景；RIP是从蛋白出发“拉”RNA（蛋白为中心），适合已知目标蛋白、需要寻找其结合的lncRNA的场景。两者互为补充，通常建议Pull-down筛选后，用RIP进行体内验证。

Q2：lncRNA复杂二级结构如何处理？

A：lncRNA常具有复杂茎环、发卡等二级结构，构象直接影响与蛋白的结合。解决策略包括：①通过RNA折叠预测工具（如Mfold、RNAstructure）分析二级结构；②RNA探针合成后通过退火处理帮助正确折叠；③设计突变型探针作为阴性对照。

Q3：lncRNA序列较长，探针如何设计？

A：lncRNA长度通常>200 nt，直接合成全长成本高且稳定性差。解决策略：①将长lncRNA分成若干功能片段分别标记后进行Pull-down；②通过重叠区域筛选共同结合蛋白，定位关键互作区段；③优先使用生物素-UTP标记（体外转录法）。

Q4：如何根据lncRNA的亚细胞定位选择蛋白提取液？

A：lncRNA在细胞内分布具有特异性——核内lncRNA参与染色质调控，胞质lncRNA参与翻译调控或信号通路。建议通过FISH或RNA测序先确定lncRNA的亚细胞定位，再针对性使用核提取物或胞质提取物进行Pull-down。

Q5：Pull-down后银染看不到互作蛋白，是什么原因？

A：可能原因及解决方案：①选取的RNA序列不对——完善lncRNA序列前期验证；②样品中没有表达互作蛋白——选择蛋白表达量较高的组织或细胞；③互作蛋白浓度低——增加上样量；④体外转录RNA降解——使用高质量转录试剂盒，全程严防RNase污染。

Q6：如何防止RNA降解？

A：RNA极易降解，全程需严防RNase污染：①所有耗材需灭菌，试剂用DEPC水配制；②操作台用RNaseZAP擦拭；③在RNA探针中添加硫代修饰防止RNase降解；④使用高浓度RNase抑制剂处理细胞裂解液；⑤处理后的耗材在两周内使用。

Q7：如何验证Pull-down找到的互作蛋白是真实的？

A：验证策略：①RIP实验反向验证——用目标蛋白的抗体进行RIP，检测lncRNA是否存在于免疫复合物中；②竞争实验——加入过量未标记lncRNA进行竞争；③RNA突变实验——设计突变型探针验证结合特异性；④纯蛋白水平验证——通过SPR、MST等方法验证结合亲和力。