一、服务概况
嘉美生物lncRNA（长链非编码RNA）与miRNA的相互作用是非编码RNA调控网络的核心环节。lncRNA可作为“miRNA海绵”（miRNA sponge），通过竞争性结合miRNA，抑制miRNA与靶mRNA的结合，从而上调靶基因的表达，这一机制被称为ceRNA（竞争性内源RNA）调控机制。
根据研究目的不同，lncRNA-miRNA互作服务主要分为以下技术路线：
1.双荧光素酶报告基因法：荧光素酶活性检测验证lncRNA与miRNA是否直接结合
2.RNA Pull-down（外源性）：qPCR检测体外验证lncRNA与miRNA结合
3.RNA Pull-down（内源性）：qPCR检测细胞内验证lncRNA与miRNA结合
4.RIP-qPCR：qPCR检测验证miRNA是否存在于蛋白-RNA复合物中
5.ceRNA调控验证：荧光素酶/qPCR/WB验证lncRNA-miRNA-mRNA三者的调控关系
二、技术原理
1. 双荧光素酶报告基因法
将待测lncRNA序列（含miRNA预测结合位点）构建到荧光素酶报告基因的下游（如psiCHECK质粒的3‘UTR区域）。将该重组质粒与miRNA mimics共转染细胞。如果miRNA能够结合lncRNA，则会抑制上游荧光素酶的表达，使荧光素酶催化底物的发光强度减弱。通过检测化学发光值（Firefly Luciferase/Renilla Luciferase比值），判断miRNA是否与lncRNA结合。
2. RNA Pull-down法（外源性）
体外转录带有生物素标记的lncRNA，与细胞裂解液孵育，形成lncRNA-miRNA-蛋白复合物。利用链霉亲和素磁珠捕获该复合物，通过qPCR检测复合物中富集的miRNA。
3. RNA Pull-down法（内源性）
将特异性RNA标签与目标lncRNA构建融合表达载体，转染细胞使其融合表达。通过与标签特异性结合的亲和介质，将RNA标签-lncRNA-miRNA复合体纯化出来，采用qPCR检测miRNA。
4. ceRNA调控机制验证
将靶mRNA的3‘UTR序列构建到荧光素酶报告基因下游，与miRNA mimics、lncRNA表达载体共转染细胞。与lncRNA空载对照组相比，当转入lncRNA表达载体时，miRNA对靶基因3’UTR的调控减弱，说明三者间存在ceRNA调控关系。
三、服务流程与技术路线
双荧光素酶报告基因法：
① 结合位点预测：利用专业软件预测miRNA与lncRNA的结合位点
② 载体构建：合成靶lncRNA序列或其miRNA结合位点序列，克隆至psiCHECK等报告基因载体
③ 质粒共转染：将报告载体与miRNA mimics共转染293T等细胞
④ 荧光检测：多功能酶标仪检测Firefly/Renilla荧光素酶活性
⑤ 数据分析：计算荧光比值，判断miRNA是否与lncRNA结合
RNA Pull-down法：
① 探针制备：体外转录制备生物素标记的lncRNA探针
② 蛋白样品制备：制备细胞/组织裂解液
③ 复合物形成：生物素化lncRNA与裂解液共孵育
④ 磁珠富集：链霉亲和素磁珠捕获复合物
⑤ RNA提取与qPCR：提取RNA，qPCR检测miRNA富集情况
四、服务说明与样本要求
1.客户提供：双荧光素酶法，lncRNA/miRNA名称、序列、物种；RNA Pull-down，lncRNA序列、细胞样本
2.细胞样本量：双荧光素酶法，约1×10⁶个/组；RNA Pull-down，≥3×10⁷个/组
3.对照设置：双荧光素酶法，突变型结合位点载体 + 空载体对照；RNA Pull-down，无探针对照 / 随机序列探针
4.保存运输：双荧光素酶法，质粒冰袋运输；细胞样本干冰运输；RNA Pull-down，样本液氮速冻后-80℃保存，干冰运输
五、交付内容
1.重组载体（含测序报告）及大肠杆菌甘油菌
2.双荧光素酶检测原始数据（Firefly/Renilla比值）及统计图表
3.RNA Pull-down产物的qPCR检测数据
4.完整实验报告（含材料与方法、原始数据等）
六、应用领域
1.ceRNA调控机制研究：验证lncRNA作为miRNA海绵，调控靶基因表达的分子机制
2.lncRNA功能机制解析：揭示lncRNA通过吸附miRNA发挥生物学功能的调控网络
3.miRNA靶标鉴定：鉴定miRNA是否靶向特定lncRNA
4.疾病机制研究：解析肿瘤、心血管疾病等中lncRNA-miRNA-mRNA调控网络
5.lncRNA-miRNA-mRNA调控网络构建：构建三者间的竞争性调控网络
6.药物靶点发现：为疾病诊断、治疗和药物研发提供新靶点
七、常见问题（FAQ）
Q1：双荧光素酶报告基因法与RNA Pull-down如何选择？
A：双荧光素酶报告基因法用于验证lncRNA与miRNA是否直接结合，通过荧光信号变化判断结合与否。RNA Pull-down用于验证lncRNA是否能够捕获/富集特定miRNA。两者可互为补充——Pull-down验证富集效率，荧光素酶验证结合特异性。
Q2：如何设置双荧光素酶实验的阴性对照？
A：为验证结合特异性，需设置突变型对照：将lncRNA序列中miRNA预测结合区域的关键碱基进行突变，构建突变型报告载体。若突变后荧光素酶活性恢复（即不再被miRNA抑制），则证实结合位点的特异性。
Q3：RNA Pull-down如何区分外源性和内源性？
A：外源性Pull-down：体外转录生物素化lncRNA与细胞裂解液孵育，操作简便，适合初步筛选。内源性Pull-down：将RNA标签与lncRNA融合表达于细胞内，在天然状态下捕获复合物，更接近生理状态。
Q4：lncRNA序列较长，如何设计双荧光素酶载体？
A：无需克隆全长lncRNA。可仅合成miRNA在lncRNA上的预测结合位点序列（通常20-30 nt），克隆至报告基因载体的3‘UTR区域。如需验证多个结合位点，可分别构建或串联构建。
Q5：ceRNA机制验证需要设置哪些实验组？
A：完整的ceRNA验证需设置：①报告基因载体 + miRNA mimics（验证miRNA可抑制靶基因）；②报告基因载体 + miRNA mimics + lncRNA过表达载体（验证lncRNA可解除miRNA的抑制作用）；③报告基因载体 + miRNA mimics + lncRNA空载对照（阴性对照）。
