一、服务概况

嘉美生物DNA pull-down是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的核心技术。该技术以生物素标记的特定DNA片段为“诱饵”，从细胞核提取物或总蛋白中捕获与之结合的蛋白质，再通过Western Blot验证已知互作蛋白，或通过质谱（MS）高通量筛选未知互作蛋白。DNA pull-down是研究转录调控、基因表达机制和疾病相关非编码区突变的有力工具。

二、技术原理

DNA pull-down的核心基于生物素-链霉亲和素的高亲和力系统：

1.探针制备：针对目标DNA区域（如启动子、增强子等调控元件）设计特异性DNA探针，并进行脱硫生物素标记。

2.磁珠偶联：生物素标记的探针与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合，形成磁珠-DNA探针复合体。

3.蛋白捕获：将磁珠-DNA探针复合体与细胞核提取物或总蛋白孵育，与探针序列特异性结合的蛋白质被吸附在磁珠上。

4.洗涤与洗脱：洗涤去除非特异性结合蛋白，洗脱得到目的DNA探针-蛋白质复合物。

5.下游检测：通过WB验证已知蛋白，或通过质谱鉴定未知蛋白。

三、服务流程与技术路线

1.方案制定：根据研究目的确定实验方案

2.DNA探针制备：针对目标调控区域设计特异性DNA探针，进行生物素标记

3.蛋白样品制备： 从细胞或组织中提取核蛋白或总蛋白

4.Pull-down实验：磁珠-DNA探针与蛋白样品孵育，捕获互作蛋白

5.洗涤与洗脱：去除非特异性结合蛋白，洗脱目的蛋白复合物

6.下游检测：WB验证已知蛋白 / 质谱鉴定未知蛋白

7.数据分析与交付：交付实验报告与检测结果

服务周期：DNA pull-down WB检测约16–25个工作日；DNA pull-down MS鉴定约10–15个工作日（质谱部分）。

四、服务说明与样本要求

1.DNA序列信息：提供目标DNA序列相关信息或DNA过表达质粒（质粒≥10μg）

2.细胞样本：冻存细胞两只或复苏细胞两瓶；细胞沉淀≥2×10⁷个

3.组织样本：动物或植物组织至少500mg

4.抗体（WB检测）：如做WB验证，需提供特定蛋白一抗及说明书

5.对照设置：必须设置阴性对照组（非生物素标记探针或无关序列探针）

6.保存运输：除复苏细胞常温运输外，其余样品均干冰运输

五、交付内容

1.含目的基因的质粒、菌液及测序报告

2.DNA Pull-down蛋白SDS-PAGE银染图

3.WB检测报告或质谱鉴定分析报告

4.所有原始数据和图像

5.完整实验报告（含实验步骤、结果分析等）

6.质控报告

六、应用领域

1.转录调控研究：鉴定启动子、增强子、沉默子等调控区域结合的转录因子及共调控复合物

2.基因表达调控机制：揭示基因转录激活或抑制的分子基础

3.疾病机制研究：研究疾病相关基因突变（尤其非编码区突变）如何影响蛋白-DNA结合

4.病毒-宿主互作研究：研究病毒DNA与宿主细胞蛋白质的相互作用

5.表观遗传调控：解析DNA甲基化、组蛋白修饰对蛋白-DNA结合的影响

6.药物靶点发现：筛选能干扰致病蛋白-DNA结合的小分子化合物

七、常见问题（FAQ）

Q1：DNA pull-down的探针长度如何设计？

A：探针长度一般控制在300–4000 bp，理想区间为1000–2000 bp。探针太短结合的蛋白太少；太长则易产生大量非特异性结合。应尽量避免序列含有大量重复结构或高GC含量。对于启动子研究，建议选择起始密码子上游1000 bp序列设计探针。

Q2：DNA pull-down应选择核蛋白还是总蛋白？

A：大多数转录因子定位于细胞核，优先选用核蛋白以减少杂蛋白干扰。若核蛋白提取困难，或研究目标为非转录因子的结构蛋白/组织蛋白，可选用总蛋白。

Q3：如何设置阴性对照？

A：常用两种方案：①非生物素标记的DNA序列作为对照组，排除链霉亲和素磁珠的非特异性结合；②无关序列（如LacZ基因或GFP序列）作为对照。

Q4：Pull-down后银染没有目的条带，是什么原因？

A：可能原因及解决方案：①样品被蛋白酶降解——添加蛋白酶抑制剂，全程4℃以下冰上操作并防止冻融；②生物素标记DNA量不足——增加探针用量；③裂解液盐碱度过高——更换低盐碱度裂解液；④细胞裂解量不足——增加细胞量。

Q5：DNA pull-down与RNA pull-down有何区别？

A：DNA pull-down使用双链DNA探针，结构稳定呈双螺旋；RNA pull-down使用单链RNA探针，可形成复杂的二级、三级结构，空间结构更复杂，因此RNA pull-down成功率通常更高、结合的蛋白更多。