一、服务概况
嘉美生物CircRNA pull-down是研究环状RNA（circRNA）与蛋白质或miRNA相互作用的核心技术之一。环状RNA是一类具有独特闭环结构的非编码RNA，可作为转录调控因子、miRNA海绵和蛋白翻译模板发挥生物学功能。CircRNA pull-down技术通过特异性捕获circRNA及其结合分子，精准解析circRNA-蛋白质互作网络及circRNA-miRNA调控关系。
该服务主要分为两种检测路线：WB验证型（验证已知互作蛋白）和MS筛选型（通过质谱高通量筛选未知互作蛋白）。根据技术原理的不同，又可分为探针法（基于生物素标记探针）和标签法（基于circRNA过表达载体引入外源标签）两大类。
二、技术原理
CircRNA pull-down目前主要有两种技术路线：
1.探针钓取法：针对circRNA特有的反向剪接连接点（backsplice junction） 设计生物素标记的反义寡核苷酸探针。探针与细胞蛋白提取液孵育后，形成circRNA-蛋白质复合物，再通过生物素-链霉亲和素的特异性结合，与链霉亲和素磁珠结合，从而将复合物从孵育液中分离出来。
2.标签法（新一代技术）：通过构建circRNA过表达载体，在circRNA中引入一段短RNA序列标签。常用的标签包括F2标签（16nt，已获国家发明专利授权）、BoxB标签和MS2标签。标签与其特异性配体具有高亲和力，可高效调取circRNA及其结合蛋白。由于标签可跨接口设计，只有形成环状RNA时标签才完整，能有效去除线性基因的背景干扰。
三、服务流程与技术路线
① 载体构建：将目的circRNA序列克隆至带标签（F2/MS2/BoxB等）的过表达载体中
② 细胞转染：将重组载体转染至目的细胞，使带标签的circRNA过表达
③ 细胞裂解 收集细胞，采用温和裂解液提取总蛋白，保留RNA-蛋白复合物天然构象
④ Pull-down富集：利用标签-配体高亲和力系统（或生物素-链霉亲和素系统）捕获circRNA及其结合分子
⑤ 洗脱与检测：洗脱复合物，通过WB验证已知蛋白，或通过LC-MS/MS鉴定未知蛋白
⑥ miRNA检测（可选）：通过qPCR检测与靶circRNA结合的miRNA
四、服务说明与样本要求
1.客户提供：circRNA名称（ID）、序列、物种；细胞样本；待测蛋白抗体（WB验证型）；实验信息表
2.细胞样本量（WB）：约3×10⁷个细胞/组（约3个10cm皿）
3.细胞样本量（MS）：约5×10⁷个细胞/组（约5个10cm皿）
4.组织样本量：富集蛋白约50mg，富集RNA约100mg
5.保存运输：-80℃保存，干冰运输
6.对照设置：需设置空载体对照或无关序列对照，排除非特异性结合
五、交付内容
1.带标签的circRNA过表达质粒及测序报告
2.circRNA成环检测qPCR结果
3.circRNA富集检测qPCR结果
4.Western Blot检测图（WB验证型）或SDS-PAGE银染图（MS筛选型）
5.LC-MS/MS质谱检测结果及互作蛋白筛选表格（MS筛选型）
6.生物信息学分析结果（GO注释、KEGG通路富集等）
7.完整实验报告
六、应用领域
1.circRNA功能机制研究：探究circRNA通过与哪些蛋白/miRNA相互作用发挥其生物学功能
2.疾病相关研究：筛选与肿瘤、心血管疾病等发生发展密切相关的circRNA及其结合蛋白
3.miRNA海绵机制验证：验证circRNA通过吸附miRNA调控下游靶基因的分子机制
4.信号通路研究：解析circRNA在细胞增殖、分化、凋亡等过程中的调控网络
5.药物靶点发现：为疾病诊断、治疗和药物研发提供新的靶点和思路
七、常见问题（FAQ）
Q1：探针法与标签法如何选择？
A：探针法适用于内源性circRNA表达丰度较高的样本，通过生物素标记探针直接捕获内源circRNA。标签法通过过表达引入外源标签，不依赖内源表达量，对低丰度circRNA同样适用，且能有效去除线性基因背景干扰。标签法已获发明专利授权，适用范围更广。
Q2：circRNA pull-down能检测与miRNA的相互作用吗？
A：可以。Pull-down富集circRNA后，可通过qPCR检测洗脱产物中特定miRNA的富集情况。如circGFRA1 pull-down实验证实miR-34a在富集产物中明显富集。
Q3：WB验证型和MS筛选型有什么区别？
A：WB验证型使用已知抗体检测特定蛋白是否与circRNA结合，适合验证已有候选互作蛋白。MS筛选型通过质谱无 bias 地鉴定所有被富集的蛋白，适合高通量筛选未知互作蛋白。
Q4：样本送样量有什么要求？
A：WB验证型建议3×10⁷个细胞/组，MS筛选型建议5×10⁷个细胞/组。如实验组和对照组均需检测，此样本量需×2。组织样本建议50-100mg。
Q5：如何设置阴性对照？
A：必须设置空载体对照（转染不带circRNA的空载体）或无关序列对照，用于排除标签/磁珠/裂解液成分的非特异性结合。探针法还需设置正义链探针对照。
Q6：实验周期和参考价格是多少？
A：载体构建及成环检测约3-4周；WB验证型总周期约5-7周；MS筛选型总周期约7-8周。价格因序列长度、细胞类型、检测方式而异，具体需咨询嘉美生物。
Q7：circRNA pull-down与RIP实验有什么区别？
A：circRNA pull-down是从circRNA出发“拉”与之结合的蛋白/miRNA（RNA为中心）；RIP是从蛋白出发“拉”与之结合的RNA（蛋白为中心）。两者互为补充，从不同角度验证RNA-蛋白相互作用。
