一、服务概况

转录组（Transcriptome）广义上指特定细胞在某一功能状态下的所有转录产物，包括信使RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA）。转录组学（Transcriptomics）利用高通量测序技术，在细胞或组织水平上对整个转录组的时空表达进行全面分析。

转录组测序（RNA-Seq）无需预先设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号、更高的检测通量以及更广泛的检测范围。相对于传统芯片杂交平台，转录组测序能够发现未知基因、检测稀有转录本，并识别可变剪接位点、融合基因、SNP及InDel变异等。

根据研究对象和目的不同，转录组学服务主要分为以下技术路线：

1.真核有参转录组测序：有参考基因组的真核生物；可全面分析mRNA序列和丰度信息、基因结构及新转录本。

2.真核无参转录组测序：无参考基因组的真核生物；通过从头组装（De novo）获得转录组信息。

3.原核转录组测序：细菌等原核生物；采用去rRNA建库方式。

4.链特异性转录组测序：需要区分正反义链转录本；可保留转录本的链方向信息。

5.全转录组测序：同时研究编码和非编码RNA；涵盖mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA等。

6.单细胞转录组测序（scRNA-seq）：研究细胞异质性；基于微流控液滴与条形码标记体系，在单细胞水平解析转录组。

7.空间转录组测序：研究基因表达的空间分布 结合组织切片与测序，获取转录本的空间位置信息。

二、技术原理

转录组测序的技术路线通常采用 “自下而上”（Bottom-Up） 策略，核心流程为：

1.RNA提取与质检：从组织或细胞样本中提取总RNA，通过电泳和分光光度计检测RNA的完整性（RIN值）和纯度。

2.文库构建：根据研究目的选择不同的建库方式——

(1)mRNA富集：利用oligo(dT)磁珠捕获带polyA尾的mRNA（适用于真核生物）

(2)去rRNA：去除核糖体RNA（rRNA），保留lncRNA等非编码RNA（适用于原核生物及lncRNA研究）

(3)小RNA富集：通过PAGE胶分离回收18-30nt的小RNA片段

富集后的RNA经反转录合成cDNA，连接测序接头，PCR扩增完成文库构建。

3.上机测序：采用Illumina等二代测序平台进行双端测序（Paired-end）。常规物种一般推荐6G数据量，基因组较小的原核生物或真菌推荐3G。数据质量要求Q20＞90%，Q30＞85%。

4.数据分析：测序数据经质控过滤后，与参考基因组比对（有参）或进行从头组装（无参），进行基因表达定量、差异分析、功能富集等一系列生物信息学分析。

三、服务流程与技术路线

转录组学服务的标准流程如下：

① 实验方案设计：根据研究目的确定样本分组、生物学重复数量（建议≥3个）及测序数据量。

② 样本采集与质检：按标准操作规程采集样本，进行RNA提取和质量评估。

③ 文库构建：根据研究目标选择mRNA富集或去rRNA等建库策略。

④ 上机测序：Illumina平台双端测序（PE150）。

⑤ 数据质控：过滤低质量数据，评估数据质量（Q20/Q30）。

⑥ 比对与定量：与参考基因组比对（有参）或从头组装（无参），进行基因/转录本表达定量。

⑦ 差异分析：筛选差异表达基因（DEG），进行GO/KEGG富集分析。

⑧ 高级分析（可选）：GSEA分析、WGCNA共表达网络分析、可变剪切分析、新转录本预测等。

服务周期

1.转录组测序（含建库、测序、基础分析）：20-30个工作日

2.单细胞转录组测序：30个工作日

3.空间转录组分析：约10个工作日

四、服务说明与样本要求

样本类型与送样量建议：

1.动物组织（柔软，如脑/脏器）：>20 mg；液氮速冻，-80℃保存

2.动物组织（坚硬，如皮肤/骨/脂肪）：>100 mg；液氮速冻，-80℃保存

3.植物叶片/花：>200 mg；液氮速冻，-80℃保存

4.植物根/茎/果实/种子：>500 mg；液氮速冻，-80℃保存

5.细胞系/原代细胞：>5×10⁶个；建议用TRIzol裂解后-80℃保存

6.总RNA：>1 μg，RIN>7.0；-80℃保存，干冰运输

7.微量细胞（单细胞测序）：1-1000个细胞（最适20-200个）；细胞活力≥80%

样本保存与运输要求：

1.组织样本建议保存在RNAlater等相关保存液中，-80℃保存

2.细胞样本使用TRIzol等裂解液充分裂解后，-80℃保存

3.全程干冰低温运输，确保样本不解冻

4.严禁反复冻融

生物学重复要求：

1.建议每组设置≥3个生物学重复

2.生物学重复可消除组内误差、增强结果可靠性、检测离群样本

五、交付内容

1.实验报告：含样本信息、实验方法、试剂仪器等完整记录

2.测序原始数据：raw data（fastq格式）

3.数据质控报告：Q20、Q30、GC含量、比对率等

4.表达定量结果：基因/转录本表达量矩阵（FPKM/TPM等）

5.差异分析结果：差异基因列表、火山图、聚类热图

6.功能富集分析：GO功能注释、KEGG通路富集气泡图

7.高级分析（可选） ：GSEA分析、WGCNA共表达网络、可变剪切分析、新转录本预测、SNP/InDel分析等

六、应用领域

1.差异基因筛选与功能分析：比较实验组和对照组基因表达量，筛选差异表达基因并进行GO/KEGG富集分析。

2.生长发育与胁迫研究：分析发育过程中时空特异性表达的基因集，研究胁迫环境下的机体响应机制。

3.疾病机制研究：揭示肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等发生发展的关键分子通路

4.临床诊断与生物标志物：筛选疾病早期诊断标志物、预后标志物。

5.肿瘤精准医学：识别融合转录本、剪接变异体等DNA分析无法检测的RNA特征。

6.药物靶点发现：发现致病基因调控的关键靶点。

7.动植物育种：研究重要性状或表型相关的关键基因。

8.单细胞与空间转录组：解析组织内细胞异质性及基因表达的空间分布。

七、常见问题（FAQ）

Q1：有参转录组和无参转录组如何选择？

A：有参转录组适用于已有高质量参考基因组的物种（如人、小鼠、水稻等），通过与参考基因组比对进行精确分析。无参转录组适用于无参考基因组的物种，通过从头组装（De novo）获得转录组信息。若参考基因组不完整或质量较差，也建议选择无参转录组。

Q2：转录组测序相比基因芯片有何优势？

A：①无需预先设计探针，可对任意物种进行全转录组分析；②覆盖度更高，深度测序可检测几乎所有转录本，能发现未知基因；③避免交叉反应和背景噪音；④提供更精确的数字化信号和更宽的检测范围。

Q3：转录组测序需要多少数据量？

A：常规动植物物种一般推荐6G数据量，基因组较小的原核生物或真菌推荐3G。基因数目较多的物种可能需要更高数据量。建议根据研究物种和目的与嘉美生物沟通确定。

Q4：RNA样本质量有什么要求？

A：总RNA建议≥1 μg，RIN值>7.0。OD260/280应在1.8-2.1之间。电泳检测应可见清晰的28S和18S rRNA条带（真核生物），无明显降解。

Q5：为什么要设置生物学重复？需要几个？

A：生物学重复可消除组内误差、增强结果可靠性、检测离群样本。建议每组设置≥3个生物学重复。样本数越多，越能降低背景差异，提高统计检验的效力。

Q6：原核生物可以做转录组测序吗？

A：可以。原核生物mRNA不含polyA尾，不能使用oligo(dT)磁珠富集，需采用去rRNA的方式进行文库构建。

Q7：什么是链特异性转录组测序？

A：链特异性建库可保留转录本的链方向信息，能够区分来源于基因组正链和负链的转录本，对于研究反义链转录本、基因重叠区域及非编码RNA的准确鉴定具有重要意义。

Q8：转录组测序的参考价格是多少？

A：实际价格因样本数量、数据量、分析深度等不同而异。