一、服务概况
微生物学实验服务主要依托高通量测序、分子生物学鉴定及传统培养技术，为环境科学、医学研究、农业生态及食品工业等领域提供微生物群落结构分析、物种鉴定、功能研究及菌种资源开发等全方位的技术支撑。
根据研究对象和目的不同，微生物学实验服务主要分为以下技术路线：
1.16S rRNA扩增子测序：细菌群落结构分析与物种鉴定；以16S rRNA基因为分子标记，分析样本中细菌的种类组成和相对丰度。
2.18S rRNA/ITS扩增子测序：真菌群落结构分析与物种鉴定；ITS区是真菌鉴定的标准DNA条形码，18S rRNA适用于真核微生物多样性分析。
3.宏基因组测序（Metagenomics）：微生物群落功能研究；对环境样本中全部微生物DNA进行随机测序，解析群落功能潜力。
4.宏转录组测序：微生物群落功能活性分析；对微生物群落全部RNA进行测序，揭示基因表达谱和代谢活动。
5.微生物基因组测序：新菌种基因组解析与比较基因组研究；包括De novo测序（从头组装）和重测序。
6.菌种鉴定：纯培养微生物的物种鉴定；通过16S rDNA/ITS测序结合数据库比对确定分类地位。
7.微生物分离纯化与培养：特定菌株的获取与保藏；从混杂微生物群体中分离目标菌株并进行纯化培养。
8.微生物菌种保藏：菌种资源的长期保存；提供公开保藏与委托保藏服务。
9.耐药基因检测：抗生素耐药性监测；通过PCR或宏基因组技术检测耐药基因。
10.微生物组单细胞测序：单细胞水平微生物群落解析；分离个体细胞并进行基因组测序。
二、技术原理
1. 16S rRNA/ITS扩增子测序
16S rRNA是细菌基因组中编码核糖体小亚基的DNA序列，由9个高变区（V1-V9）穿插着保守区组成。通过扩增高变区（如V3-V4区）并进行高通量测序，可区分鉴定绝大多数细菌。真菌则通过扩增ITS（内转录间隔区，位于18S与5.8S之间以及5.8S与28S之间）或18S rRNA基因进行鉴定。这些序列兼具高度保守性（可用于通用引物设计）和种属间高变性（可用于物种区分），非常适合环境微生物群落结构研究。
2. 宏基因组测序
宏基因组学以特定环境中的微生物群体基因组为研究对象，通过随机打断微生物总DNA、构建插入片段文库并进行双端高通量测序来研究微生物的功能活性、多样性、种群结构和进化关系。与传统方法相比，宏基因组测序规避了绝大多数微生物无法培养、痕量菌无法检测的缺点。
3. 菌种鉴定（Sanger测序法）
提取微生物基因组DNA后，使用通用引物PCR扩增目标区域（细菌16S rDNA约1,500 bp，真菌ITS区等），对PCR产物进行测序，将所得序列与GenBank等数据库进行比对，确定微生物的分类地位。
三、服务流程与技术路线
微生物学实验服务的标准流程如下：
扩增子测序
① 样本采集：按标准操作规程采集环境/临床/食品等样本
② 核酸提取：提取样本总DNA
③ 文库构建：PCR扩增目标区域（16S/ITS），构建测序文库
④ 上机测序：Illumina PE250/300或PacBio平台
⑤ 数据质控：过滤低质量数据，评估数据质量
⑥ 数据分析：OTU聚类、物种注释、多样性分析
⑦ 结果交付：交付数据与分析报告
宏基因组测序
① 样本采集：按标准操作规程采集环境/临床/食品等样本
② 核酸提取：提取样本总DNA
③ 文库构建：DNA片段化，构建300 bp测序文库
④ 上机测序：Illumina等平台双端测序
⑤ 数据质控：过滤低质量数据，评估数据质量
⑥ 数据分析：组装、基因预测、物种与功能注释
⑦ 结果交付：交付数据与分析报告
菌种鉴定
① 样本采集：提供纯化3次以上的菌株或菌液
② 核酸提取：提取基因组DNA
③ 文库构建：PCR扩增目标片段
④ 上机测序：Sanger测序
⑤ 数据质控：序列拼接与质控
⑥ 数据分析：数据库比对鉴定
⑦ 结果交付：交付鉴定报告与系统发育树
服务周期：
1.细菌16S rDNA鉴定：1-2周
2.真菌ITS鉴定：1-2周
3.微生物多样性测序：3-10日（扩增服务）
4.宏基因组测序及分析：根据数据量而定
四、服务说明与样本要求
样本类型与送样量建议：
扩增子测序
1.DNA样品：≥4 μg，浓度≥50 ng/μL，OD260/280 1.8-2.0
2.土壤：10 g
3.粪便：3-5 g
4.污泥：5-10 g
5.血液：10 mL
6.组织样本：≥200 mg
宏基因组测序：同上
菌种鉴定
1.DNA样品：≥5 μL（菌液）
2.菌液/菌株：≥5 mL
样本保存与运输要求：
1.环境样本（土壤/粪便/污泥等）：采集后液氮速冻或-80℃保存，干冰运输
2.DNA样品：-20℃短期保存，-80℃长期保存，冰袋或干冰运输
3.菌株样品：纯化3次以上的纯培养物，常温或4℃运输
4.严禁反复冻融
生物学重复要求：
建议每组设置≥3个生物学重复；组间差异统计分析（如Metastats、LEfSe）要求每组至少3个重复
五、交付内容
扩增子测序/宏基因组测序：
1.测序原始数据（fastq格式）及质控报告
2.OTU聚类及分类学分析结果
3.物种组成分析（饼图、柱状图、热图、进化树等）
4.Alpha多样性指数及稀释性曲线
5.Beta多样性分析（PCA、PCoA、聚类分析等）
6.组间差异物种分析（Metastats、LEfSe）
7.功能注释（GO、KEGG、COG、CAZy、CARD等数据库）
8.完整实验报告
菌种鉴定：
1.PCR产物电泳图
2.碱基序列
3.系统发育树
4.鉴定报告（含分类地位及置信度）
六、应用领域
1.环境微生物监测：土壤、水体、空气、沉积物中微生物群落结构与多样性分析
2.人体微生态研究：肠道、口腔、皮肤、呼吸道微生物组与疾病关联分析
3.临床病原检测：病原微生物筛查、耐药基因检测、医院感染控制
4.食品与药品安全：食品微生物污染分析、益生菌鉴定、药品无菌检验
5.农业与生态：植物根际微生物、土壤肥力评估、堆肥微生物组
6.工业微生物：发酵菌群监测、工业废水处理微生物、生物制剂质量控制
7.新菌种资源开发：特定功能微生物筛选、分离纯化与保藏
8.微生物进化与生态：微生物系统进化分析、群落网络构建、环境因子关联分析
七、常见问题（FAQ）
Q1：16S rRNA测序和宏基因组测序如何选择？
A：16S rRNA测序成本较低，适合研究微生物群落组成、多样性和物种差异，但不能直接揭示功能信息。宏基因组测序可同时获得物种组成和功能基因信息，适合研究微生物群落的功能潜力、代谢通路和耐药基因等。若关注“有什么菌”，选16S；若关注“菌能做什么”，选宏基因组。
Q2：菌种鉴定需要提供什么样的样品？
A：菌种鉴定要求提供纯化3次以上的纯培养菌株。菌液样品建议≥5 mL。若菌种不纯，测序会出现套峰，导致鉴定结果误差。鉴定结果一般可鉴定到种，个别菌种因数据库缺乏相关数据，只能鉴定到属。
Q3：样本采集和保存有哪些关键注意事项？
A：①环境/临床样本采集后立即液氮速冻或-80℃保存，防止微生物群落结构发生变化；②干冰运输，确保全程不解冻；③严禁反复冻融；④取样部位保持一致，避免个体差异；⑤建议每组设置≥3个生物学重复。
Q4：微生物学实验的参考价格是多少？
A：实际价格因样本数量、测序深度、分析要求等不同而异。
Q5：生物学重复需要设置几个？
A：建议每组设置≥3个生物学重复。进行组间差异统计分析（如Metastats、LEfSe）时，若无生物学重复或重复数少于3，统计分析将没有统计学意义。
Q6：微生物菌种可以委托保藏吗？
A：可以。
Q7：什么是微生物组单细胞测序？
A：微生物组单细胞测序技术能够在单细胞水平上解析复杂的微生物群落，通过分离微生物的个体细胞并对其进行基因组测序，提供前所未有的细节视角来观察微生物生态系统的多样性和功能。
Q8：宏转录组测序与宏基因组测序有何不同？
A：宏基因组测序检测样本中全部微生物的DNA，反映“存在哪些菌及功能潜力”；宏转录组测序检测样本中微生物群落的全部RNA，反映“哪些基因正在活跃表达”，可揭示微生物的代谢活动和环境适应性。
