一、服务概况

表观遗传学（Epigenetics）是指在基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达发生可遗传变化的一门遗传学分支学科。DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印记、RNA编辑、基因沉默、休眠转座子激活及性别相关性基因剂量补偿效应等，都是典型的表观遗传现象。

表观遗传学实验服务依托高通量测序、分子生物学及生物信息学分析平台，提供从DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质开放性到非编码RNA调控等全维度的表观遗传图谱构建服务。

根据研究层次和目的不同，表观遗传学服务主要分为以下技术路线：

转录前调控：MSP、BSP、ChIP、ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC-seq、MeDIP-seq、WGBS、RRBS、EMSA、DNA Pull-down、DAP-seq、酵母单杂交（Y1H）；主要研究内容为DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质开放性、转录因子-DNA互作。

转录后调控：RIP、RIP-seq、RNA Pull-down、双荧光素酶报告系统；主要研究内容为非编码RNA调控、RNA-蛋白互作。

二、技术原理

表观遗传学各技术方向的核心原理如下：

DNA甲基化检测

1.重亚硫酸盐测序（Bisulfite Sequencing）：用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不变，通过测序区分甲基化与未甲基化位点。

2.全基因组甲基化测序（WGBS）：将重亚硫酸盐处理与高通量测序结合，实现单碱基分辨率的全基因组甲基化检测。

3.甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-seq）：利用5'-甲基胞嘧啶特异性抗体富集甲基化的DNA片段，结合高通量测序在全基因组水平寻找甲基化区域。

4.甲基化特异性PCR（MSP）：用重亚硫酸盐处理基因组DNA后，设计甲基化和非甲基化特异性引物进行PCR扩增，通过电泳判断甲基化状态。

5.亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）：重亚硫酸盐处理后，用特异性引物扩增目标片段并克隆测序，获得单个C位点的甲基化信息。

组蛋白修饰与转录因子-DNA互作

1.染色质免疫共沉淀（ChIP）：利用特异性抗体富集与目标蛋白（转录因子、修饰组蛋白）结合的DNA片段，通过qPCR（ChIP-qPCR）验证已知靶序列或高通量测序（ChIP-seq）全基因组筛选。

2.CUT&Tag：新型蛋白-DNA互作研究方法，利用抗体引导Protein A-Tn5融合蛋白在目标蛋白结合的DNA位置进行切割并添加测序接头，信噪比高、所需细胞量少。

3.ATAC-seq：利用Tn5转座酶切割染色质开放区域的DNA并插入测序接头，通过测序推断全基因组染色质可及性。

4.DAP-seq：体外表达带有亲和标签的转录因子蛋白，与基因组DNA文库孵育后亲和纯化结合的DNA片段，进行高通量测序鉴定转录因子结合位点。

5.EMSA（凝胶迁移实验）：基于蛋白-探针复合物在凝胶电泳中迁移速率慢于游离探针的原理，检测蛋白质与核酸的相互作用。

转录后调控

1.RIP（RNA结合蛋白免疫沉淀）：利用特异性抗体沉淀RNA-蛋白复合物，通过qPCR验证（RIP-qPCR）或测序（RIP-seq）鉴定结合的RNA。

2.RNA Pull-down：利用生物素标记的RNA探针捕获与其结合的蛋白质。

3.双荧光素酶报告系统：通过检测荧光素酶活性变化，验证ncRNA与靶标分子的调控关系。

三、服务流程与技术路线

以高通量测序类表观遗传学服务为例，标准流程如下：

1.实验方案设计：根据研究目的确定技术路线、样本分组及生物学重复数量

2.样本采集与处理：按标准操作规程采集样本，进行核酸提取或染色质制备

3.文库构建：根据技术路线进行重亚硫酸盐处理、免疫共沉淀、转座酶切割等建库操作

4.上机测序：Illumina等平台进行高通量测序

5.数据质控：过滤低质量数据，评估数据质量

6.生物信息学分析：比对参考基因组、甲基化位点检测/Peak calling、差异分析、功能富集等

7.结果交付：交付原始数据、分析结果及实验报告

服务周期：

1.全基因组甲基化测序（WGBS）：40-60个工作日

2.简化基因组甲基化测序（RRBS）：40-60个工作日

3.ChIP-seq：40-50个工作日

4.MeDIP-seq：40-45个工作日

5.MSP（甲基化特异性PCR）：约30个工作日

四、服务说明与样本要求

样本类型与送样量建议：

1.全基因组甲基化测序（WGBS）：≥3 μg 基因组DNA，≥100 ng/μL，OD260/280 1.8-2.0。

2.简化基因组甲基化测序（RRBS）：≥4 μg DNA，OD260/280 1.8-2.0。

3.ChIP-seq：≥30 ng 抗体富集后DNA。

4.MeDIP-seq：≥30 ng 抗体富集后DNA。

5.ChIP-seq（测序DNA）：≥10 ng（可低至5 ng）。

样本保存与运输要求：

1.组织/细胞样本建议液氮速冻后-80℃保存，干冰运输

2.DNA样品可短期-20℃保存，长期-80℃保存

3.严禁反复冻融

4.FFPE样本需评估DNA质量，特殊情况可处理低至250 ng的FFPE样本

5.对照设置要求：ChIP/ChIP-seq实验需设置Input（片段化总DNA对照）和IgG同型对照（阴性对照）；甲基化检测需设置甲基化阳性对照和非甲基化阴性对照。

五、交付内容

1.原始数据：测序原始数据（fastq格式）

2.数据质控报告：Q20/Q30、比对率、覆盖度等

3.甲基化分析结果：甲基化位点列表、差异甲基化区域（DMR）、甲基化水平分布图等

4.ChIP-seq/CUT&Tag分析结果：Peak calling结果、motif分析、peak关联基因注释等

5.ATAC-seq分析结果：染色质开放区域鉴定、转录因子足迹分析等

6.生物信息学分析：GO功能注释、KEGG通路富集、UCSC Genome Browser可视化等

7.完整实验报告：含实验方法、试剂信息、仪器参数等

六、应用领域

1.疾病机制研究：解析肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等的表观遗传调控机制

2.生物标志物发现：挖掘疾病早期诊断、预后评估的表观遗传标志物

3.药物靶点筛选：优化药物靶点筛选及个性化医疗方案设计

4.发育生物学：研究胚胎发育、细胞分化过程中的表观遗传动态变化

5.动植物育种：研究重要性状的DNA甲基化调控机制，为分子育种提供依据

6.肿瘤免疫：解析肿瘤免疫微环境的表观遗传调控

7.环境与营养：研究环境、营养等因素对特定基因甲基化的影响

七、常见问题（FAQ）

Q1：ChIP-seq和CUT&Tag如何选择？

A：ChIP-seq是经典方法，适用于常规组蛋白修饰和转录因子研究，技术成熟，但所需细胞量较大（通常需数百万细胞）。CUT&Tag是新兴方法，所需细胞量更少（可低至数百至数千个细胞）、信噪比更高、实验周期更短。CUT&Tag对低丰度转录因子的检测效果优于ChIP-seq，尤其适用于稀有样本或低丰度蛋白研究。细菌样本因有细胞壁且无完整核结构，不适合做CUT&Tag。

Q2：WGBS和MeDIP-seq在甲基化研究中有何区别？

A：WGBS（全基因组甲基化测序）可达到单碱基分辨率，精确分析每一个胞嘧啶的甲基化状态，适合需要精细甲基化图谱的研究，但成本较高。MeDIP-seq（甲基化DNA免疫共沉淀测序）利用抗体富集甲基化片段，检测范围覆盖全基因组，成本相对较低，适合大样本量筛查和大范围甲基化区域比较。此外，MeDIP-seq无需已知基因组序列信息，可适用于任意物种。

Q3：ATAC-seq与ChIP-seq有何不同？

A：ChIP-seq针对特定转录因子或组蛋白修饰的结合区域进行研究，需要特异性抗体。ATAC-seq能够捕获所有开放的染色质区域（即所有潜在活跃的调控序列），而不限于与特定因子结合的区域。ATAC-seq适用于探索样本内整体的表观遗传变化，寻找活跃转录的调控序列。

Q4：ChIP-seq的DNA样本需要多少量？

A：ChIP-seq测序DNA样本通常需要≥10 ng，随着建库技术不断完善，低至5 ng的DNA也能建库成功。尽量要求20 ng，可通过协商根据具体情况降低送样要求。对于转录因子等低丰度蛋白，最终捕获的DNA量可能较低，建议提前与嘉美生物沟通。

Q5：DAP-seq与ChIP-seq有何区别？

A：两者核心区别在于是否需要抗体。ChIP-seq依赖蛋白特异性抗体在体内捕获与蛋白结合的DNA片段。DAP-seq在体外表达转录因子蛋白，与裸露的基因组DNA文库孵育后进行亲和纯化，不依赖抗体，适用于缺乏高质量抗体的转录因子研究。

Q6：MSP和BSP在甲基化检测中有何区别？

A：MSP（甲基化特异性PCR）通过设计甲基化和非甲基化特异性引物进行PCR扩增，经电泳判断甲基化状态，操作简便快速。BSP（亚硫酸氢盐测序PCR）将PCR产物克隆后测序，可获知每个C位点的具体甲基化情况，信息更精确。MSP适合初步筛查，BSP适合精细分析。

Q7：表观遗传学实验的参考价格是多少？

A：实际价格因样本数量、测序深度、分析要求等不同而异。