一、服务概况

嘉美生物SYBR Green染料法荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是一种基于荧光染料技术的核酸精确定量检测方法。该方法通过实时监测扩增过程中荧光信号的变化，对DNA或RNA样本进行相对定量、绝对定量及定性分析。SYBR Green染料法依托SYBR Green I荧光染料，具有操作简便、成本较低、灵敏度高、重复性好、自动化程度高、无污染等特点。该方法适用于芯片数据验证、基因表达分析、miRNA检测、SNP分型、病原菌检测、基因拷贝数测定等领域，可针对组织、细胞、血液、RNA、cDNA等多种样本类型提供全流程技术服务。

二、技术原理

SYBR Green I是一种非对称花菁类荧光染料，能与双链DNA的小沟区域特异性结合。在游离状态下，该染料的荧光信号极弱；当结合到双链DNA上时，染料分子受限于空间旋转产生构象变化，荧光信号显著增强，其激发和发射最大值分别在494nm和521nm。在qPCR扩增过程中，每个循环产生的双链DNA与染料结合，使荧光信号强度与双链DNA数量成正比，通过实时采集荧光信号实现对扩增产物的动态监测。

由于SYBR Green I能与所有双链DNA非特异性结合，包括引物二聚体和非特异性扩增产物，因此需要配合熔解曲线分析（Melt Curve Analysis）进行验证。熔解曲线分析通过逐步升温使DNA变性，荧光信号骤降，其导数视图可呈现单一特征峰的扩增产物，用于区分目标产物与引物二聚体等杂质。

三、服务流程与技术路线

① 样本接收与质检：接收组织、细胞、血液、RNA、cDNA等样本，对样本进行质量评估。

② RNA/DNA提取：使用Trizol或相应试剂盒提取总RNA或DNA，测定纯度和浓度（OD260/280：RNA 1.9–2.1，DNA 1.7–1.9）。

③ 逆转录合成cDNA：提取的RNA经逆转录酶反转录为cDNA（DNA样本可跳过此步骤）。

④ 引物设计与验证：根据靶基因序列设计特异性引物，进行梯度PCR和标准曲线验证引物扩增效率。

⑤ 预实验条件优化：确定最佳退火温度、引物浓度、模板上样量等反应参数。

⑥ qPCR正式实验：采用SYBR Green Master Mix，每样本重复3个复孔进行qPCR扩增。

⑦ 熔解曲线分析：qPCR运行结束后进行熔解曲线分析，确认扩增特异性。

⑧ 数据分析与报告：相对定量采用2^–ΔΔCt法，绝对定量需构建标准曲线（标准品≥5个浓度梯度）。

四、服务说明与样本要求

各样本类型的具体要求及运输保存条件如下：

1、动物组织：常规组织≥100mg；脂肪、结缔、纤维化组织需适当增加，-80℃或液氮贮存，干冰运输。建议加入Trizol后冻存。

2、培养细胞：≥1×10⁶～1×10⁷个，离心收集细胞沉淀，加入Trizol后-80℃贮存，干冰运输。

3、植物组织：嫩叶、果肉、种子等≥100mg，取材后液氮速冻，-80℃贮存，干冰运输。

4、血液：新鲜EDTA抗凝全血≥1mL，加入Trizol后-80℃贮存，干冰运输。

5、血清/血浆：≥1mL，干冰运输。

6、RNA：≥1μg（浓度≥100ng/μl），OD260/280 1.9–2.1，-80℃贮存，干冰运输。

7、DNA：≥1μg（浓度≥50ng/μl），OD260/280 1.7–1.9，-20℃贮存，冰袋运输。

8、cDNA：≥20μl，内参基因检测成功，-20℃贮存，冰袋运输。

服务提醒：客户还需提供目的基因的种属、名称、Gene ID等信息。如需委托嘉美生物设计引物，则需提供全基因序列或GenBank登录号。

五、交付内容

1、实验数据：扩增曲线、熔解曲线、Ct值、原始检测数据

2、引物信息：引物序列（含内参引物，内参通常免费提供）

3、标准曲线（适用于绝对定量）：标准品构建图谱、标准曲线及R²值分析

4、实验报告：含实验方法、步骤、所用试剂、仪器参数、数据分析结果的完整报告（发表级图表）

5、质量控制数据：RNA完整性电泳图、内参基因验证结果

六、应用领域

1、基因表达分析：mRNA、lncRNA、circRNA在不同组织、不同处理条件下的表达差异检测。

2、microRNA检测：miRNA表达谱分析，只需1–10ng总RNA或50pg miRNA即可完成检测。

3、芯片数据验证：基因芯片、RNA-seq结果的qPCR验证。

4、病原体定量检测：病毒（HBV、HCV、HIV）、细菌（结核杆菌）、真菌等病原微生物拷贝数定量。

5、转基因鉴定：转基因动植物拷贝数检测。

6、SNP分型：单核苷酸多态性的基因分型分析。

7、RNAi效果评估：siRNA敲低效率验证。

8、绝对定量：质粒拷贝数、DNA拷贝数、病毒载量精确测定。

七、常见问题（FAQ）

Q1：无Ct值（信号）出现，可能是什么原因？

A：可能原因包括：① PCR循环数不足——一般设置35–45个循环；② 引物降解——使用新合成的引物；③ 模板量不足——适当提高模板起始量；④ 热启动时间不够——检查热启动是否为15min；⑤ 检测荧光信号采集步骤有误——SYBR Green法通常在72℃延伸步骤采集荧光信号。

Q2：Ct值偏大（如>30）如何解决？

A：Ct值偏大提示模板含量低或扩增效率低。建议：① 增加模板量，观察Ct值能否成相应倍数减少；② 检查引物设计是否合理，优化反应条件以提高扩增效率；③ 确保cDNA质量和RNA完整性良好。

Q3：熔解曲线出现多峰或峰形异常，说明什么问题？

A：SYBR Green染料法需要通过熔解曲线验证扩增特异性。单一特征峰表明只扩增了一个产物；出现多个峰、主峰上的肩部或异常宽峰，提示可能存在引物二聚体或非特异性扩增产物。建议：① 重新设计引物并验证特异性；② 优化退火温度（梯度PCR）；③ 通过琼脂糖凝胶电泳进一步确认扩增产物。

Q4：复孔间Ct值差异大（SD>0.3），如何排查？

A：差异过大可能原因：① 反应体系配制不均一——充分混合Master Mix并轻离心排气泡；② 加样误差——建议使用排枪加样；③ 反应中出现气泡或蒸发——避免产生气泡，使用合适的密封膜；④ 模板降解——检查RNA/DNA完整性。

Q5：阴性对照出现扩增曲线，表示什么？如何处理？

A：表示可能存在气溶胶污染或引物二聚体。需进行熔解曲线分析以确认污染来源。处理建议：① 彻底清洁操作台和环境，使用带滤芯吸头；② 设置无模板对照（NTC）和阳性对照；③ 使用UDG酶处理反应液降解含dU的扩增产物；④ 严格分区操作（试剂配制区、样本处理区、扩增分析区器材不混用）。

Q6：SYBR Green染料法与TaqMan探针法如何选择？

A：SYBR Green染料法：成本低、实验设计简单、可配合熔解曲线分析，适合基因表达差异初筛、大规模样本检测等成本敏感型项目，但不能实现多重检测。TaqMan探针法：特异性更强、准确度更高、可实现多靶点同时检测（多重qPCR），适合临床诊断、病原体精密定量等高要求应用场景，但需合成探针、成本较高。