一、服务概况

嘉美生物软琼脂集落形成实验（Soft Agar Colony Formation Assay），又名非锚定依赖性生长实验（Anchorage-independent Growth Assay），是一种在软琼脂半固体培养基中评估细胞体外致瘤能力和增殖能力的经典检测方法。该方法通过模拟体内肿瘤生长环境，将单细胞悬液悬浮于软琼脂基质中，观察细胞能否在缺乏锚定支撑的条件下独立增殖形成细胞集落（克隆）。

软琼脂集落形成实验与平板克隆形成实验均用于评价细胞克隆形成能力，二者核心区别在于：平板克隆要求细胞贴壁生长后形成克隆，适用于常规贴壁细胞；软琼脂克隆则利用琼脂半固体培养基将细胞“挂”起来，使其在悬浮状态下生长，主要应用于各类非锚着依赖性生长的细胞——恶性转化细胞、肿瘤细胞、悬浮细胞系及骨髓造血干细胞等。正常成纤维细胞等依赖贴壁存活的细胞在悬浮状态下难以增殖，不适用于本法。

二、技术原理

软琼脂集落形成实验的核心原理基于正常细胞与肿瘤细胞在生长方式上的根本差异：大多数正常细胞需要贴附于固体基质（锚定依赖性）才能存活和增殖，而恶性转化的肿瘤细胞获得了在悬浮状态下独立增殖的能力（锚定非依赖性生长），这一特性与其体内致瘤潜能高度相关。

软琼脂克隆形成法通过构建双层琼脂体系为细胞提供半固体支撑环境：底层为1.2%琼脂凝固层（起支撑作用），上层为0.7%琼脂与细胞混合层（细胞悬浮于其中）。在此半固体基质中，只有具备锚定非依赖性生长能力的细胞才能克服缺乏贴附屏障的困境，通过分泌自身生长因子、抵抗失巢凋亡，逐步分裂增殖形成肉眼可见的细胞集落（克隆）。克隆形成率与细胞恶性程度和体内成瘤性呈正相关——体外软琼脂中形成克隆的能力越强，体内致瘤潜能越高。该方法2-3周即可完成，是肿瘤恶性表型评估和药效体外验证的快速替代模型。

三、服务流程与技术路线

① 单细胞悬液制备：取对数生长期、状态良好的细胞，0.25%胰酶消化，离心收集细胞沉淀，重悬并轻柔吹打成单细胞悬液（>95%分散度），台盼蓝染色评估活细胞率>90%，活细胞计数调整密度至约1×10³/mL。

② 底层琼脂铺板：制备1.2%琼脂，高压灭菌后于40℃水浴锅中维持液态，与2×完全培养基按1:1混合，铺于6孔板（每孔1.5mL）或24孔板（每孔0.8mL），37℃孵育30 min使其凝固。

③ 上层细胞琼脂铺板：将0.7%琼脂与2×完全培养基按1:1混匀（维持40-42℃），加入单细胞悬液充分混匀，上层胶铺于凝固的底层琼脂之上。6孔板每孔1.5mL（每孔500-5000个细胞），24孔板每孔0.8mL（每孔约40个细胞），每组设3个复孔。

④ 克隆培养：最上层加入约1mL完全培养基防止琼脂干燥，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养1-3周，每3天换液一次并观察细胞状态，直至克隆直径达0.3-1.0mm（肉眼可见）时终止培养。

⑤ 固定与染色：弃去培养基，PBS轻柔洗涤2次，4%多聚甲醛固定30-60 min，0.05%结晶紫染液染色10-30 min，去除残留染液并自然干燥。

⑥ 克隆计数与数据分析：显微镜下计数含≥50个细胞的克隆，计算克隆形成率：克隆形成率 = (克隆数 / 接种细胞数) × 100%，采用t检验分析不同组间差异。

四、服务说明与样本要求

1、细胞样本：提供处于对数生长期、活率>90%、生长状态良好的细胞株，若无支原体污染更佳。需注明细胞名称、种属、培养条件及是否经过基因修饰/药物处理。

2、细胞数量：软琼脂实验通常需提供约1×10⁷个细胞，用于预实验摸索接种密度（一般24孔板每孔30-50个细胞）和正式实验复孔重复。

3、细胞来源：可自备细胞株，或委托嘉美生物代购（需提供细胞名称、来源及培养条件）。

4、待测药物/样品：如需进行药物干预，提供待测化合物及背景信息（溶解性、处理浓度及方案），药物可在实验开始时加入培养基，建议说明是否全程维持药物。

5、实验方案：明确实验目的、细胞类型、分组设置及特殊处理要求，并建议提供已知高克隆形成率的阳性对照细胞株以验证体系。

6、运输须知：冻存细胞干冰运输，培养中活细胞用装满完全培养基的培养瓶寄送（封口膜封口），2-8℃运输；药物等液态样品需低温冷藏，冻干样品可常温或4℃寄送。

五、交付内容

1、成品6孔板（或24孔板）克隆染色平皿照片及高倍显微镜下各处理组克隆形态照片。

2、克隆计数原始数据：含各孔克隆数、克隆形成率及统计显著性分析。

3、完整实验报告：含细胞培养条件、药物处理方案、琼脂配制方法、染色步骤及数据分析方法。

4、原始实验数据及分析结果（含克隆形成率Excel数据表）。

5、可选增值服务：克隆形成抑制曲线绘制（药物浓度梯度分析）、克隆直径定量测量、显微镜全孔扫描拼接图、集落形成效率软件定量分析。

服务周期：10-20个工作日，基因敲除或稳转细胞模型建立等复杂项目约需4-8周。

六、应用领域

1、肿瘤恶性程度评估：软琼脂中克隆形成能力是肿瘤细胞获得锚定非依赖性生长表型的直接体现，形成克隆的数量和大小可定量反映细胞恶性转化程度——转化越完全的细胞，克隆形成率越高、集落越大

2、抗癌药物筛选与药效评价：检测候选药物对肿瘤细胞锚定非依赖性增殖的抑制效果，筛选有效化合物；比较不同药物浓度对克隆形成的抑制作用，绘制剂量-效应曲线，定量评估药效

3、基因功能与信号通路研究：验证过表达或特定基因敲低后细胞在软琼脂中的生长变化，鉴定影响细胞转化和增殖能力的关键基因；结合CRISPR筛选技术研究肿瘤发生相关调控网络

4、肿瘤干细胞鉴定：软琼脂克隆形成实验是评估肿瘤干细胞自我更新能力的重要指标之一，可量化分选出的CD133⁺/CD44⁺干细胞样细胞的体外致瘤能力

5、细胞转化实验（体外致瘤性检测）：NIH3T3等成纤维细胞转染癌基因后，在软琼脂中形成了集落提示获得了锚定非依赖性生长能力；桥接了体外转化表型与体内致瘤潜能，是细胞转化检测中最具说服力的指标

6、药物联合治疗策略评估：在多种抗肿瘤药物联合使用场景下，评估其对肿瘤细胞锚定非依赖性增殖的协同抑制作用，优化用药方案组合

7、新药临床前筛选和安全性评价：对新型抗肿瘤候选化合物进行体外克隆形成率变化评估，快速评价其抑制肿瘤增殖的活性，为新药进入动物实验和相关安全性评估提供参考依据

七、常见问题（FAQ）

Q1：平板克隆形成实验与软琼脂集落形成实验有何区别？如何选择？

A：平板克隆实验中细胞直接在培养皿表面贴壁生长，适用于常规贴壁细胞，操作简便、克隆形成率较高；缺点在于细胞易移动，且无法区分贴壁依赖性增殖与锚定非依赖性生长能力。软琼脂克隆实验中细胞悬浮于半固体琼脂中，仅那些获得锚定非依赖性生长能力的细胞才能增殖形成克隆，直接反映了细胞的恶性转化程度和体内致瘤潜能。除肿瘤细胞外，软琼脂适用于悬浮细胞、骨髓造血干细胞和转化细胞系。初筛建议采用平板克隆评价增殖能力，涉及肿瘤恶性表型评估或致瘤性验证时应选择软琼脂法。

Q2：实验中克隆形成率低或无克隆形成，原因有哪些？

A：可能原因：①细胞本身不具备锚定非依赖性生长能力（如正常二倍体成纤维细胞），其在悬浮状态下不能增殖、不适用。肿瘤细胞系克隆形成率通常可达到10%以上，而初代培养细胞仅为0.5%-5%。②琼脂温度过高（>42℃）烫伤或杀死细胞，或琼脂反复加热降解产生毒性。③细胞消化未充分分散为单细胞悬液或接种密度过低，克隆起始数量不足。④培养条件不适宜，可尝试在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质提高克隆形成率。

Q3：接种多少细胞最合适？

A：以24孔板为例，每孔30-50个细胞已足够——过少则统计误差大，过多则克隆密集计数困难。接种密度需根据细胞增殖能力和恶性程度调节：增殖极强的高恶性细胞可减少至20个/孔，增殖较弱的细胞可适当增加至100个/孔。6孔板每孔500-5000个细胞（依据细胞种类而定），建议通过预实验梯度浓度（如每孔100、200、500、1000个）摸索最佳接种密度。一般原则：肿瘤细胞选较低密度，正常或转化程度低的细胞适当提高密度。

Q4：琼脂与细胞混合时如何控制温度？

A：琼脂温度是实验成败的关键。琼脂溶液在高压灭菌后置于40℃恒温水浴锅中维持液态，与2×完全培养基混合后应保持在40-42℃。温度过高（>45℃）易造成部分细胞死亡，温度过低（<37℃）则琼脂迅速凝固结块导致局部细胞密度不均。建议使用预温至37℃的完全培养基和移液枪头，全程快速操作确保在琼脂凝固前完成铺板。

Q5：软琼脂克隆形成实验对细胞状态有何要求？

A：细胞必须处于对数生长期、活率>90%、无细菌真菌及支原体污染。长期传代（超过40代）的细胞可能出现功能衰退和克隆形成能力下降。针对药物敏感性测试或基因功能验证，建议在实验前将细胞传代至5-10代以内，以保证结果的稳定性。所有样品均需在实验前通过台盼蓝染色或细胞活力检测仪确认活细胞率。

Q6：克隆形成率高低与体内成瘤性有什么关系？

A：克隆形成率与体内成瘤性呈正相关——体外软琼脂中克隆形成能力越强，细胞在动物体内形成肿瘤的可能性越高，增殖速度也越快。肿瘤细胞获得锚定非依赖性生长能力是恶性转化的关键表型之一，与其致瘤潜能高度相关。因此软琼脂克隆形成率高低可作为体外评价细胞恶性程度和高低成瘤能力的快速筛选方法。

Q7：软琼脂实验适用于哪些细胞类型？

A：主要适用于非锚着依赖性生长的细胞：恶性转化的肿瘤细胞（多种癌种细胞株）、悬浮细胞系、骨髓造血干细胞及生长因子依赖性转化细胞系等。正常成纤维细胞、大部分正常二倍体细胞及大多数初代培养细胞依赖于贴壁存活，在悬浮状态中不易增殖形成克隆，因此不适用于软琼脂实验。