一、服务概况

嘉美生物划痕实验（Wound Healing Assay），又称细胞划痕实验或细胞创伤愈合实验，是一种操作简单、经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。该方法在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其他硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，观察划痕边缘细胞逐渐进入空白区域使“划痕”愈合的过程。

因其类似体外伤口愈合过程，又名伤口愈合实验，可用于观察药物、基因等外源因素对细胞迁移、修复和相互作用的影响。该方法服务可针对肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞等多种贴壁细胞类型提供全流程技术支持。

二、技术原理

划痕实验的原理是：当细胞生长至融合成单层状态时，在细胞层上人为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”。通过一段时间的培养，边缘的细胞会逐渐向无细胞区域迁移，使“伤口”愈合，通过测量不同时间点的划痕间距并计算差值，可对细胞的迁移能力做出判断。该方法在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，非常适合研究细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移，且与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。

三、服务流程与技术路线

划痕实验的标准操作流程如下：

① 细胞铺板：用marker笔在6孔板（或12孔板、24孔板）背后，用直尺比着，均匀划横线，每孔至少穿过5条线，方便拍照时定位同一视野。

② 细胞接种：消化细胞后接入孔板，细胞数量以贴壁后铺满板底为宜，一般约5×10⁵个细胞/孔（6孔板）。

③ 制造划痕：第二天细胞融合度达90%–100%时，用200μl或10μl移液枪头垂直于背后的横线制造划痕，枪头需垂直且力度均匀，保证各划痕宽度一致。

④ 清洗：吸去培养液，用PBS轻柔洗涤孔板2–3次，去除划痕产生的细胞碎片和悬浮细胞。

⑤ 加液培养：加入无血清或低血清培养基（通常血清浓度<2%），以消除细胞增殖对实验结果的影响。

⑥ 拍照记录：用倒置显微镜在0h、6h、12h、24h等预设时间点拍照记录，每孔至少选取5个视野。

⑦ 数据分析：测量各时间点划痕区域的宽度，计算划痕愈合面积百分比或细胞迁移速率，进行结果统计分析。

服务周期：7–10个工作日，具体需根据细胞生长情况及实验内容而定。

四、服务说明与样本要求

1、细胞样本：客户需提供生长状态良好的贴壁细胞株，注明细胞名称、培养条件（培养基种类、血清浓度、传代比例等）；冻存细胞需干冰运输；活细胞需用装满培养液的培养瓶寄送并封口。

2、待测药物/试剂：如涉及药物或化合物处理，需提供待测样品及相关背景信息（溶解性、稳定性、处理浓度、溶剂类型、处理方式等）。

3、对照信息：建议提供阳性对照（如已知有促进细胞迁移作用的药物或处理方式）用于体系验证。

4、接种密度参考：6孔板约5×10⁵个细胞/孔；12孔板约2×10⁵个细胞/孔；24孔板约1×10⁵个细胞/孔（具体需根据细胞类型经预实验确定）。

5、特殊说明：一般做划痕实验时使用无血清或者低血清（<2%）培养基，否则细胞增殖会干扰迁移结果的判断。

注：如样本具有致病性或传染性，请提前申报，以便在相应的生物安全等级下进行操作。

五、交付内容

1、显微图片：各时间点（0h、培养后等）划痕区域的高清定格图像。

2、计数分析数据：迁移距离测量值、愈合面积百分比计算、迁移速率等原始数据。

3、统计结果图表：迁移率对比柱状图或愈合曲线（客户可选）。

4、完整实验报告：包含实验材料（细胞株信息、试剂来源）、详细实验步骤、数据分析方法及结果说明。

5、剩余样品：按需返还客户提供的剩余细胞和药品。

六、应用领域

1、肿瘤转移机制研究：评估药物、基因调控（过表达/沉默）对肿瘤细胞迁移能力的影响，筛选转移相关关键基因。

2、抗肿瘤药物筛选：检测候选药物对肿瘤细胞迁移能力的抑制效果，为药物开发提供体外药效学依据。

3、伤口愈合与再生医学：评估成纤维细胞、表皮细胞在生长因子或药物处理下的迁移能力，研究组织修复机制。

4、化妆品修复功效评价：模拟皮肤受损后的自然愈合过程，评估化妆品成分对促进皮肤修复和愈合的效果。

5、血管生成研究：利用内皮细胞（如HUVEC）迁移实验，评价促血管生成/抑制血管生成因子或药物的活性。

6、基因功能研究：验证敲低或过表达特定基因对细胞迁移表型的影响，结合RNA干扰或CRISPR技术表征新基因功能。

7、胚胎发育生物学：神经嵴细胞定向迁移、胚胎早期血管发生过程中内皮细胞迁移行为分析。

七、常见问题（FAQ）

Q1：划痕实验与Transwell迁移实验有什么区别？如何选择？

A：划痕实验操作简单、成本低，在单层细胞上直接制造空白区域观察细胞向划痕区的边缘迁移，非常适合初步评估细胞迁移能力和进行大规模药物筛选；但人工制造划痕难以保证宽度一致，后续通过图像分析定量也需要手动获取数据。Transwell迁移实验通过微孔膜定量检测穿过膜的细胞数，结果更客观、可重复性更好，但成本稍高、操作稍复杂。一般建议：初筛阶段采用划痕实验判定细胞迁移趋势，精确定量验证阶段采用Transwell迁移实验获取确切的迁移率数据。

Q2：铺板密度如何确定？

A：细胞接种密度需保证在划痕处理时细胞融合度达到90%–100%为宜（即细胞基本长满单层），具体细胞数因细胞类型和孔板规格而异。6孔板一般约5×10⁵个细胞/孔，12孔板约2×10⁵个细胞/孔，24孔板约1×10⁵个细胞/孔。密度过高会导致细胞层过厚、难以划出清晰划痕或细胞堆积堵塞划痕区域；密度过低则划痕后边缘细胞数量不足，难以形成有效迁移。建议通过预实验对客户提供细胞类型进行接种密度梯度实验，确定最佳接种量和铺板后过夜能长满的细胞数目。

Q3：划痕操作时有什么注意事项？

A：划痕操作的规范化程度直接影响实验结果的一致性。①枪头选择：常用的移液枪头是200μl，也可使用10μl枪头制造更细的划痕；②角度控制：枪头需垂直于孔板底部（90度角），不可倾斜；③力度必须轻柔均匀，一次成型，不宜来回划动；④定位标志：划线前用marker笔在孔板底部均匀画横线作为参考线，划痕垂直于参考线，形成若干交叉点作为固定的测量点和拍照定位点。嘉美生物采用专用的细胞划痕贴膜或划痕插件，可制备宽度一致、可重复性更高的划痕区域，显著降低实验者间的操作误差。

Q4：划痕后如何清洗去除细胞碎片？用PBS冲洗时需要注意什么？

A：清洗步骤的温柔与否决定了单层细胞在洗涤过程中不被破坏。具体要点：①吸去原培养基后，沿孔壁缓慢加入PBS，用移液器小心吹打或轻轻摇晃孔板清洗，避免冲洗力直接冲击细胞单层；②对于漂浮细胞和碎屑较少的样本，一般洗涤2–3次即可完全清除；③是否使用Tip头吸走残余细屑时，吸头不可接触孔底细胞层；④清洗完毕后，应镜下观察划痕区域是否干净，无残留碎屑和悬浮细胞。

Q5：划痕后用什么培养基？为什么不能用完全培养基？

A：划痕后应使用无血清或低血清（<2%）培养基。主要原因是：如果使用含高浓度血清（10%FBS）的完全培养基，细胞在划痕后培养过程中会发生明显增殖，导致划痕愈合效果中既包含了细胞迁移的贡献，也包含了细胞增殖的贡献，从而使实验结果无法真实反映细胞迁移能力。一般常规划痕实验设置无血清培养基（0%FBS），可完全排除增殖干扰；对某些对低血清环境敏感的细胞可加<2%FBS维持基本活力，但需注意增殖仍会产生偏倚，需在对照中评估增殖效应。

Q6：如何提高划痕实验定量结果的准确性？

A：①划线前在孔板底面画横线定位，确保每次拍照位置高度一致；②每孔随机选取至少5个视野（避开孔边缘区域），取平均值作为愈合面积的测量结果；③采用ImageJ软件中的“划痕愈合分析插件”或高内涵成像系统进行自动化批量处理和面积分析，显著提升测量的客观性和可重复性；④可设置预涂FN（Fibronectin）或胶原的处理组来促进细胞迁移，同时与未处理组对比观察迁移性差异；⑤每个实验条件至少设置3个复孔确保统计效力。

Q7：划痕实验结果的常用定量指标有哪些？

A：常用的定量指标包括：①划痕愈合面积百分比（Wound Closure, %）：愈合面积% = (0h划痕面积－实验终止时划痕面积)/0h划痕面积×100%；②迁移率（Migration Rate, μm/h）：迁移速率= (初始划痕宽度t1－终末划痕宽度t2)/(t2−t1)；③每个时间点细胞整体迁移距离计算：迁移距离=该时间点划痕宽度－原始0h划痕宽度。在ImageJ中划痕区域会自动生成轮廓，分析各时间点的愈合比例和迁移速率的比较，反映不同处理组对细胞迁移作用的促进或抑制效应。

Q8：客户提供细胞样本时需要注意什么？

A：客户需提供处于对数生长期的活细胞（传代后1-2代内），并注明细胞株的来源、培养条件（培养基类型、血清浓度、抗生素、是否经过基因修饰等）。细胞状态是决定划痕质地和迁移速率的先决条件——长期传代（高代次）的细胞可能出现功能衰退和迁移能力下降，影响结果的稳定性。对于冻存细胞，推荐用干冰运输（-80℃严格保存）；对于活细胞，则使用装满完全培养基的培养瓶寄送并用封口膜封口（维持瓶身正置，2-8℃低温运输），确保细胞在运输过程中不出现大范围污染或凋亡。建议提供客户常用的染色体系（如有特殊固定需求也应明确说明）。

（A）体外划痕愈合实验的代表性图像显示，与对照组（溶剂处理）相比，在0.4% (w/v) SDP存在下，细胞向无细胞区域（轮廓线所示）的迁移显著加速（比例尺：200 μm）。
（B）柱状图汇总显示了划痕愈合实验中不同时间点的伤口愈合百分比（*P < 0.01 vs. 对照组；#P < 0.001 vs. 0.2% SDP；†P < 0.001 vs. 0.4% SDP；n = 3）。
（C）汇总图显示了在不同浓度SDP存在下上皮细胞的典型伤口愈合（迁移）速率
（*P < 0.05 vs. 对照组；**P < 0.01 vs. 对照组；***P < 0.001 vs. 对照组；N = 3次实验，每个处理组n = 3个孔）。