一、服务概况

嘉美生物维多利亚蓝-天狼星红复合染色是一种将两种经典染色方法（维多利亚蓝弹力纤维染色与天狼星红胶原纤维染色）相结合的双重染色技术，可在单一切片上同时显示组织的弹力纤维和胶原纤维分布，广泛应用于心血管疾病、肝纤维化研究、肺癌病理诊断和组织工程评估等领域。与单独染色相比，复合染色不仅可在一张切片上完成双指标分析，还便于在同一视野下直接观察两种纤维成分的共存与相互位置关系，结果对比清晰、色彩鲜艳且不易褪色。该服务主要针对组织石蜡切片进行染色，不适用于培养细胞或细胞爬片样本。

二、技术原理

维多利亚蓝-天狼星红复合染色基于两套独立的染色体系依次完成，原理互不干扰。

维多利亚蓝部分：维多利亚蓝是一种碱性染料，在间苯二酚介导下与弹力纤维中的弹性蛋白（富含二硫键糖蛋白）通过氢键、范德华力和疏水作用等非极性吸附作用特异性结合，使弹力纤维染成蓝绿色。由于染液稳定性高，在室温下可长期保存且可反复使用，染色效果不受影响。

天狼星红部分：天狼星红是一种强酸性染料，每个分子含6个磺酸基，在酸性条件下与胶原分子中带正电的碱性氨基酸侧链通过静电作用牢固结合，使胶原纤维呈红色。在偏振光显微镜下，天狼星红可增强胶原纤维的自然双折射性，Ⅰ型胶原（厚纤维）呈橙红色或亮红色强双折射光，Ⅲ型胶原（细纤维）呈绿色弱双折射光，为此技术区分不同胶原亚型提供了独特的鉴别工具。

染色结果： 弹力纤维呈蓝绿色；胶原纤维呈红色；红细胞及肌肉呈浅黄色；细胞核（若经苏木素或核固红复染）呈红色或浅蓝色。

三、服务流程与技术路线

本服务的核心是“先维多利亚蓝，后丽春红-天狼星红”——维多利亚蓝染液在95%乙醇中分色后立即浸入蒸馏水洗脱，才进行丽春红-天狼星红染色。其染色方案如下：

① 脱蜡至水：二甲苯脱蜡→梯度乙醇水化至70%乙醇，约30-40 min。

② 维多利亚蓝染色：切片入70%乙醇洗2 min，浸入维多利亚蓝染液浸染（加盖），0.5-24 h（依组织类型调整）。

③ 乙醇分色：入95%乙醇中快速分色数秒钟，至玻片表面无染液附着为止，约10 s。

④ 蒸馏水洗涤：蒸馏水洗2 min，显微镜下观察弹力纤维着色程度，2 min。

⑤ 丽春红-天狼星红染色：天狼星红饱和苦味酸液滴染切片（加盖），5-30 min（依胶原含量而定）。

⑥ 无水乙醇脱水：无水乙醇直接分化脱水，从切片一端冲洗多余染液，不可水洗，快速2次。

⑦ 空气干燥：将切片斜放，在空气中或冷风中稍干燥（防止产生黑色颗粒），约1-2 min。

⑧ 透明封片：二甲苯透明→中性树胶封固，约5 min。

⑨ 显微镜镜检：普通光学和偏振光分别观察，图像采集与分析。

细节说明：维多利亚蓝染液中的有效成分易挥发，染色操作以加盖浸染为佳，染液在室温中保存可用数年，可反复使用且效果不减，每次染色时间还可相应缩短。丽春红-天狼星红染色后不能与水直接接触，必须直接用无水乙醇冲洗脱水，以免染色效果消退；脱水后需避免过于干燥，否则切片表面易产生黑色颗粒，影响镜检。

四、服务说明与样本要求

1、适用样本类型：主要适用于FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织切片，可用于心血管、肺、肝、肾、皮肤等多种组织类型；不适用于培养细胞或细胞爬片等样本。

2、固定要求：10%中性福尔马林或4%多聚甲醛固定，固定时间12-24 h，固定液体积至少为组织的20倍；固定时间过长（超过72 h）会导致弹性纤维抗原性下降，染色浅淡。

3、石蜡切片：厚度4-6 μm，常温干燥保存与运输；送达前确保蜡块已在高质量固定液中完成固定和包埋。

4、冰冻切片：-20℃运输保存（夏季加冰袋）；复合染色不常用，如需进行应提前确认染色条件。

注意事项：送样前请避免样本反复冻融（尤其冰冻样本固定效果较差）；所有染色前操作请在标准组织病理实验室进行以确保组织质量；如实提供阳性对照切片者，可辅助实验室优化染色方案。

五、交付内容

1、维多利亚蓝-天狼星红双染色成品玻片（石蜡切片）

2、石蜡蜡块

3、高清数字图像或全切片扫描图像：普通光学下弹力纤维（蓝绿色）和胶原纤维（红色）对比图像 + 偏振光下胶原亚型分型图像（Ⅰ型呈橙红色/亮红色强双折光、Ⅲ型呈绿色弱双折光）

4、完整实验报告（含所用试剂、方法步骤、结果判读）

5、可选增值服务：胶原纤维面积百分比定量分析、Ⅰ/Ⅲ型胶原比例分析、弹性纤维增生/断裂程度评分、纤维化分级评估、病理学分析报告等。

服务周期：14-21个工作日

六、应用领域

1、心血管疾病研究：显示心内膜弹性纤维异常增生和高血压小动脉壁增厚；评估动脉粥样硬化中弹性纤维的崩解、断裂与消失；检测心肌梗死后胶原沉积和弹性纤维的重塑变化。

2、肝纤维化与肝硬化：弹性纤维在慢性肝病组织中逐渐增加，复合染色可同时追踪弹性纤维增生和胶原纤维沉积，研究从慢性肝炎到肝硬化肝纤维化的动态演变过程。

3、肺癌病理诊断：显示胸膜中的弹力纤维层，判断肿瘤是否侵犯脏层胸膜（弹力纤维膜断裂与胶原纤维侵入）；辅助非小细胞肺癌精确分期（pT2a vs pT3/pT4）和指导治疗方案。

4、肺疾病研究：评估老年性肺气肿中的弹性纤维断裂、变性或萎缩；观察特发性肺纤维化不同阶段的胶原沉积模式。

5、皮肤病理：评估皮肤组织中弹力纤维的增生、断裂或减少；辅助诊断弹力纤维痣、环状肉芽肿、皮肤老化等疾病。

6、肾脏组织与血管病变：评估肾脏组织和肿瘤血管的纤维病变；检测各种实验动物组织中血管壁的纤维损害和增生情况。

7、结缔组织与再生医学：评估胶原纤维的数量、排布和弹性纤维的重塑情况；为组织工程支架植入后基质重构效果提供病理学依据。

七、常见问题（FAQ）

Q1：什么是维多利亚蓝和天狼星红？为什么选择复合染色而不是分别染色评判？

A：维多利亚蓝是一种碱性染料，只能特异性显示弹力纤维，胶原纤维不着色；天狼星红是一种强酸性染料，特异性显示胶原纤维和免疫球蛋白沉积。两种染色机制完全不同，分别显示弹力纤维和胶原纤维。将它们结合在一起后，不仅能在一张切片上同时显示两种组织成分，节省样本和操作时间，还能在同一视野直接观察弹力纤维与胶原纤维的共存与相互位置关系，对于深入研究纤维化过程中弹性纤维增生伴随胶原纤维沉积等病理变化具有独特价值。

Q2：染色顺序为什么必须是“先维多利亚蓝，后丽春红-天狼星红”？顺序调换会有什么后果？

A：这是本染色方案的核心要求。如果将顺序倒置（先丽春红-天狼星红后维多利亚蓝），丽春红-天狼星红已牢固结合胶原纤维，后续维多利亚蓝染液无法再有效与弹力纤维结合，导致弹力纤维染色失败甚至根本不着色。因此，必须保证严格按照“先维多利亚蓝—后丽春红-天狼星红”的顺序进行操作，才能在同一张切片上获得弹性纤维（蓝绿色）和胶原纤维（红色）的清晰对比。

Q3：丽春红-天狼星红染色后为什么不可以直接水洗？

A：丽春红-天狼星红染色是利用染料与胶原纤维间的静电作用完成结合，该结合可逆，水洗会直接将结合不牢固的染料冲走，造成胶原纤维红色褪去、结果明显变浅甚至完全不着色。正确操作是直接用无水乙醇从切片一端快速冲洗，使乙醇瞬间将多余的染料从组织表面移走，同时留下与胶原纤维牢固结合的染料。乙醇脱水后需在空气中或冷风下稍干燥，避免黑色颗粒析出。

Q4：维多利亚蓝染色过浅或弹力纤维不着色，应从哪些方面排查？

A：①检查固定方式：固定时间过长（超过72 h）或固定液含有铬盐等异常成分，会损伤弹性纤维结构，导致染色能力显著下降，建议固定时间控制在24 h左右；②检查染液状态：维多利亚蓝染液虽然可以反复使用，但染液老化（数年以上）或有效成分被污染物吸附，也能导致染色效果显著下降；③检查分化程度：95%乙醇分色时间过长（超过15 s）会将已结合的染料完全洗脱，出现假阴性，分色后务必立即浸入蒸馏水终止脱色。

Q5：偏振光下如何区分Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维？两者的比值有什么临床意义？

A：在偏振光显微镜下，天狼星红染色的胶原纤维会显示双折射效应。Ⅰ型胶原纤维粗大、排列紧密，呈橙红色或亮红色强双折光；Ⅲ型胶原纤维纤细、结构疏松，呈绿色弱双折光。在肝纤维化和心肌纤维化过程中，Ⅰ/Ⅲ型胶原比例显著升高，Ⅰ型胶原的过量沉积与器官结构重塑和功能损伤密切相关。测定Ⅰ/Ⅲ型胶原面积百分比不仅可辅助定量纤维化程度分级（轻、中、重度），还可为抗纤维化药物疗效评价提供形态学量化指标。

Q6：样本固定不当会对复合染色结果产生哪些影响？

A：①固定时间过长（>72 h）：弹力纤维与胶原纤维均过度交联，染料难以进入组织内部，染色结果逐渐减弱甚至呈阴性，使弹性纤维蓝绿色变为淡灰色而难以识别；②使用含铬盐的特殊固定液：可能破坏弹力纤维的分子结构，导致维多利亚蓝染色效果极差，胶原纤维着色也相应减弱；③固定液体积不足：组织未能充分固定，弹性纤维和胶原纤维易在后续步骤中变形或流失——固定液体积至少应为样本体积的20倍。

Q7：非特异性着色或背景过深，如何判断和解决？

A：复合染色出现非特异性背景的主要原因及解决方案如下：①维多利亚蓝染色后95%乙醇分色不足：分色时间控制在10 s左右，显微镜下观察到弹性纤维与背景颜色明显分化即可，不可分色过度；②自来水中的铁离子与染料结合：染色全程必须使用蒸馏水洗片，尤其在维多利亚蓝染色前切片必须用蒸馏水充分清洗；③染液污染或操作未严格遵循“先维多利亚蓝-后丽春红-天狼星红”顺序：改用新配染液或重新染色一次。

Q8：复合染色做完后还能再做免疫组化（IHC）吗？

A：可以做，但一般建议以IHC为主——先完成抗体标记和DAB显色，最后再以天狼星红进行细胞外基质的复染。天狼星红染色使用的酸性条件和长时间的染色暴露会破坏某些抗原表位，导致IHC标记失败。如果既要显示胶原纤维又要进行弹性蛋白或胶原亚型的免疫组化检测，建议先完成IHC，最后再在天狼星红中短时间染色（10 min内），以平衡染色效果和抗原保护。

Q9：维多利亚蓝-天狼星红复合染色结果如何保存？

A：封片后应在显微镜下尽快观察和图像采集。天狼星红染色封片保存时红染逐渐趋向透光而变淡，弹力纤维的蓝绿色也会随保存时间推移慢慢褪色。建议在封片后1-2周内完成图像采集和数据定量分析。长期保存需于室温避光、防潮存放，避免重物压片。