一、服务概况

嘉美生物普鲁士蓝染色，也称Perls染色或铁染色，是一种特异性地显示三价铁离子（Fe³⁺）的组织化学方法，由病理学家Perls最早建立并应用于组织化学检测领域，已有超过150年的应用历史。该方法主要显示含铁血黄素（hemosiderin），可用来观察组织细胞中有无铁元素存在，以及铁元素存在的位置及含量，是检测组织铁沉积的“金标准”手法。依据复染方法的不同，普鲁士蓝染色可分为核固红法、伊红法和中性红法等类型。该服务可针对石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片及骨髓涂片等多种样本类型提供检测。

二、技术原理

1、普鲁士蓝染色的核心是基于一个经典的组织化学反应。在酸性（稀盐酸）条件下，组织内与蛋白质结合的三价铁离子（Fe³⁺）被解离释放出来，与染色液中提供的亚铁氰化钾（K₄[Fe(CN)₆]）发生复分解反应，生成一种不溶于水的蓝色化合物——亚铁氰化铁（Fe₄[Fe(CN)₆]₃），即普鲁士蓝。这种蓝色沉淀会稳定地沉积在铁离子所在的原始位置，从而在显微镜下形成清晰的蓝色标记。反应液通常由亚铁氰化钾溶液和盐酸溶液等体积混合而成，需现用现配。

2、该方法的灵敏度高（可达0.01μg铁/100g样品）、特异性强、染色结果稳定，单次反应生成的普鲁士蓝化合物具有高稳定性，后续可用核固红、伊红或中性红等进行复染以增强对比度。

3、染色结果：铁元素或含铁血黄素呈蓝色或亮蓝色颗粒；细胞核经核固红复染后呈红色；背景呈浅红色或无色。

三、服务流程与技术路线

① 脱蜡至水：石蜡切片依次放入二甲苯（20min×2次）→无水乙醇（5min×2次）→75%酒精（5min）→自来水洗→蒸馏水洗3遍，约40–50 min。

② 普鲁士蓝染色：等体积混合亚铁氰化钾溶液与盐酸溶液（现配现用），配成普鲁士蓝染液，切片入染液中染色，30–60 min。

③ 蒸馏水洗：蒸馏水轻柔漂洗2-3次，洗去多余染液，2–5 min。

④ 核固红复染：入核固红染液，使细胞核着色，1–5 min。

⑤ 流水冲洗：流水冲洗返蓝，去除多余复染液，约2 min。

⑥ 脱水透明：梯度乙醇脱水→二甲苯透明，约10–15 min。

⑦ 封片：中性树胶封固。

⑧ 显微镜镜检：观察并记录结果。

染色时间：对于已知高含铁量的样本，染色10分钟即可；对于低含铁量的样本，可延长至30分钟或1小时，并在显微镜下监控染色进程。染液应现配现用，染色过程中需防止染液挥发变干。

四、服务说明与样本要求

1、固定组织（石蜡包埋）：约1×1×0.5 cm，推荐使用10%中性缓冲福尔马林固定，固定时间12–24 h，固定液体积至少为组织的20倍；选Bouin氏液、Zenker氏液等含酸或含铬酸盐的固定液会溶解/螯合铁，导致假阴性结果；固定时间过长（>1周）可能导致铁溶解流失，出现假阴性。

2、新鲜组织（冰冻切片）：离体后0.5h内放入4%多聚甲醛或10%中性福尔马林固定，干冰运输，-20℃或-80℃保存。

3、石蜡蜡块：蜡块完整，常温运输和保存。

4、石蜡切片：切片厚度4–6 μm，常温干燥保存和运输。

5、冰冻切片：-20℃运输（夏季加冰袋），避光避湿保存。

6、细胞爬片：4%多聚甲醛固定15 min，PBS覆盖，4℃运输和保存。

7、骨髓涂片：新鲜涂片，常温运输。

注意事项：① 全程必须使用无铁器械和蒸馏水，严禁使用金属镊子、铁丝染色篮等铁制工具，自来水管生锈也可能引入铁离子污染，造成广泛假阳性背景。② 每次染色均应设置阳性对照（已知含铁血黄素沉积的脾脏或肝切片）和阴性对照（用蒸馏水代替反应液），以确保染色成功和结果可信度。③ 陈旧样本染色效果欠佳时，可用25%高锰酸钾处理切片20–60 min再以草酸漂白，可激活残存铁离子，但易出现假阳性，观察时需注意鉴别。

五、交付内容

1、普鲁士蓝染色成品玻片（石蜡切片/冰冻切片/细胞爬片）

2、石蜡蜡块

3、高清数字图像（常规每张切片提供1–3张代表性图像）或全切片扫描图像

4、完整实验报告（含所用试剂、仪器、方法步骤、染色结果判读等）

5、可选增值服务：铁沉积面积半定量分析、铁含量评分（如Gale评分系统）、图像定量分析报告、病理学诊断分析报告等

服务周期：7–10个工作日。

六、应用领域

1、出血性病变与含铁血黄素沉积：显示陈旧性出血灶（如慢性心力衰竭时肺淤血导致的“心力衰竭细胞”），在判断色素是否为含铁血黄素时，普鲁士蓝染色是关键证实手段，可有效区分含铁血黄素与胆色素、脂褐素等其他内源性色素。

2、系统性铁过载疾病：检测遗传性血色病、输血依赖性贫血（如地中海贫血）导致的继发性铁过载时肝、脾、骨髓等实质器官的铁沉积程度和分布模式，为诊断和疗效评估提供形态学依据。

3、骨髓铁染色与贫血鉴别：评估骨髓网状内皮细胞中的“细胞外铁”以及有核红细胞内的“细胞内铁”（铁粒幼红细胞），是鉴别缺铁性贫血和其他类型贫血的重要指标。

4、神经退行性疾病研究：在脑出血模型、帕金森病模型中验证铁沉积是否成功诱导，评估脑内铁代谢异常与神经损伤的关系。

5、炎症与免疫研究：巨噬细胞在吞噬和处理红细胞过程中涉及铁的回收，染色可用于追踪和观察巨噬细胞内的铁处理过程。

6、磁性纳米颗粒示踪：特异性标记磁性纳米颗粒中的Fe³⁺成分，直观观察其在体内的分布、蓄积和代谢清除情况。

7、肿瘤治疗评估：观察肿瘤治疗后铁颗粒在组织中的分布和沉积情况。

8、材料表征（体外）：快速定性检测材料（如纳米复合物）中是否含有铁氧化物成分。

七、常见问题（FAQ）

Q1：普鲁士蓝染色的本质是什么？为什么被称为组织铁检测的“金标准”？

A：普鲁士蓝染色的本质是Fe³⁺与亚铁氰化钾在稀酸性条件下发生的复分解反应，生成不溶于水的蓝色亚铁氰化铁沉淀。化学反应式为：4Fe³⁺ + 3[Fe(CN)₆]⁴⁻ → Fe₄[Fe(CN)₆]₃↓。该方法灵敏度高（可达0.01μg铁/100g样本）、特异性强、染色结果稳定不易褪色，能清晰定位组织中的三价铁离子位置，在铁代谢相关研究和病理诊断中具有不可替代性。

Q2：染色后无蓝色信号（假阴性），可能是什么原因？

A：可能原因包括：① 固定剂选择不当——使用Bouin氏液等含酸或含铬酸盐的固定液会溶解或螯合铁，导致铁流失，应使用10%中性缓冲福尔马林；② 固定时间过长（>1周）——长时间福尔马林固定可能导致铁溶解流失；③ 反应液失效——亚铁氰化钾与盐酸混合后应现配现用，放置过久会失效；④ 样本本身铁含量极低——可适当延长染色时间或使用DAB加强法提高检测灵敏度；⑤ 脱蜡不彻底——组织切片经甲醛固定后未完成对游离醛基的彻底清洗。解决方法：更换新鲜固定剂、现配现用反应液、延长染色时间至1小时以上。

Q3：如何防止背景染色过深或出现非特异性蓝色沉淀？

A：背景过深最常见的原因是染色过程中引入了外源性铁污染。全程必须使用无铁器械和蒸馏水，切忌使用金属镊子、铁丝染色篮等铁制工具接触样本或染液。染色前切片应用蒸馏水充分冲洗，避免使用自来水洗涤，因为自来水管生锈后水中可能含有微量铁离子，会在切片上形成广泛的蓝色背景沉淀。此外，反应液混合后应充分过滤以去除可能存在的沉淀颗粒。

Q4：为什么普鲁士蓝染液必须现配现用？不过滤会有什么后果？

A：亚铁氰化钾与盐酸溶液等体积混合后，染液中的活性成分稳定性有限，2–3小时后反应能力显著下降，因此每次染色前应新鲜配制。混合后的染液可能产生少量沉淀颗粒，若不经过滤直接染色，沉淀颗粒会附着于组织表面和背景中，在镜下形成非特异性的蓝色颗粒干扰判读。操作要点：混合后静置5–10分钟，用0.22 μm滤膜或滤纸过滤后使用。

Q5：核固红复染时间过长会有什么影响？

A：核固红复染时间过去会导致细胞核过深、红色背景过重，使蓝色铁颗粒与红色背景之间的对比度下降，干扰阳性信号的识别和判读。建议复染时间控制在1–5分钟，染完后流水冲洗返蓝。如复染过染严重影响结果判读，可将切片放入1%盐酸酒精中快速褪色后重新复染。

Q6：如何区分普鲁士蓝染色阳性信号与组织内其他色素沉着？

A：普鲁士蓝染色的阳性信号应为镜下清晰、边界分明、颗粒状的亮蓝色沉淀或团块，常见于吞噬细胞内或组织间质中。需特别注意与某些染料沉淀、组织褶皱、杂质颗粒或脂褐素（HE下呈金褐色但普鲁士蓝反应阴性）区分。Perls反应是区分含铁血黄素与胆色素、脂褐素等其他内源性色素的最可靠方法。

Q7：石蜡切片和冰冻切片在普鲁士蓝染色处理上有何区别？

A：石蜡切片需经过完整的脱蜡至水处理（二甲苯脱蜡→梯度乙醇水化至蒸馏水），恢复组织亲水性和染料渗透性，脱蜡不彻底会导致染色不均匀；冰冻切片无需脱蜡，可直接染色或短暂的乙醇脱脂处理后染色，步骤更简短。两种切片的染色步骤基本一致，统一按照标准流程操作即可。

Q8：DAB加强法普鲁士蓝染色与常规普鲁士蓝染色有何区别？

A：常规普鲁士蓝可直接检测组织中浓度较高的三价铁，生成蓝色沉淀；但当组织中铁元素含量极微时，蓝色信号难以显现，此时可采用DAB加强法。在常规普鲁士蓝反应基础上加入DAB，使DAB与沉淀态的三价铁发生氧化还原反应形成棕色化合物，可显著增强检测的特异性，显示出组织中的微量铁元素。

Q9：普鲁士蓝染色能否用于含钙骨组织样本？

A：可进行，但需要特别注意固定液的选择和处理流程。骨组织等钙化标本在做常规石蜡包埋切片时必须先行脱钙处理（推荐使用EDTA温和脱钙法），否则钙盐会阻碍刀片切割且影响染液渗透。固定液推荐使用10%中性缓冲福尔马林，脱钙后需充分水洗去除脱钙液残留，再按常规流程进行染色。

Q10：染色后切片如何保存？

A：完成脱水透明并用中性树胶密封封固后，应在显微镜下尽快观察和图像采集。长期保存时需于4℃或室温下避光、防潮存放，避免重物压片。注意避免高湿度和紫外线照射，虽然普鲁士蓝产物本身稳定性较好，但复染的核固红染色成分长期保存可能褪色。建议在封片后两周内完成图像采集和数据定量分析。