一、服务概况

嘉美生物LFB染色（Luxol Fast Blue Staining），又称劳克坚牢蓝染色，是髓鞘染色的金标准方法，由Kluver和Barrera于1953年建立。LFB属于铜－酞箐染料，在酒精溶液中具有与髓鞘磷脂特异性结合的染色特性，使神经髓鞘呈鲜亮的蓝色，能够清晰显示髓鞘的形态结构、分布及病理变化。该技术广泛应用于多发性硬化、脊髓损伤、脑缺血、周围神经病变等脱髓鞘疾病的研究中，是评估髓鞘损伤程度与修复效果不可或缺的组织化学手段，可对石蜡切片、冰冻切片等多种样本类型提供检测。

二、技术原理

LFB染料属于磺化铜酞菁型化合物（一种深蓝绿色的芳香族大环化合物），是醇溶性染料。其染色基于髓鞘脂蛋白的酸－碱反应与盐形成机制：染液中的染料阳离子与髓鞘脂蛋白中的碱基结合，形成不溶性复合物，染色后的髓鞘呈亮蓝色，背景保持无色至浅蓝色。LFB染色的髓鞘呈现的可逆病理变化包括：病变早期着色较深呈蓝色；中期髓鞘变性形成脂滴，蓝色变浅；晚期髓鞘彻底溃变并被吞噬细胞清除，形成空洞，不再有蓝色阳性结果。

三、服务流程与技术路线

① 脱蜡至水：二甲苯脱蜡后经梯度乙醇水化至95%乙醇（石蜡切片），冰冻切片经乙醇脱脂处理后直接进入95%乙醇，约30-40 min。

② LFB染色：入0.1% LFB溶液，于60℃密封浸染，石蜡切片8-16 h，冰冻切片不超过16 h。总时间约8-16 h。

③ 洗涤：95%乙醇洗去多余染色液，再蒸馏水洗，1-2 min。

④ 分化：0.05%-0.1%碳酸锂溶液分色约10-30 s，10-30 s。

⑤ 二次分化：70%乙醇分色，显微镜下控制至灰质清晰、白质鲜明，背景无色为止，约30 s-2 min。

⑥ 水洗：蒸馏水洗涤 1-2 min。

⑦ 复染：可选焦油紫（染色神经元尼氏体）或伊红（染色细胞质及组织），焦油紫2-5 min，伊红30-60 s。总时间约1-5 min。

⑧ 脱水透明封片：正丁醇漂洗脱水→二甲苯透明→中性树胶封固，约10-15 min。

备注：分化和复染步骤可在镜下精确控制，确保白质区域染色鲜明、灰质区域背景干净。LFB染色的条件包括组织准备、染色温度保持至少60°C，分化步骤中LFB与碳酸锂和酒精试剂均可分化脱色，在镜检下完成到白质清晰鲜明为止。

四、服务说明与样本要求

1、新鲜脑/脊髓/外周神经组织：离体后0.5h内放入4%多聚甲醛或10%中性福尔马林固定，固定液体积≥10倍样本体积，常温运输送样；切勿固定时间过长，切勿冷冻结冰。

2、石蜡蜡块（包埋后）：信封包装后常温保存与运输。

3、石蜡切片：推荐切片厚度5-8μm；常温干燥保存与运输。

4、冰冻切片：-20℃运输（夏季加冰袋），新鲜组织须干冰运输。

5、整体鼠脑、脊髓或坐骨神经：多聚甲醛固定后蔗糖脱水，OCT包埋后冰冻切片。

备注：预期染色区域为大脑、脊髓，以及坐骨神经等周围神经组织。甲醛固定的FFPE石蜡包埋组织块需提供适当厚度切片；若制片失败，可要求取回重切玻片送回后重新作业。

五、交付内容

1、LFB染色成品玻片（石蜡切片/冰冻切片）

2、石蜡蜡块

3、高清数字图像或全切片扫描图像

4、完整实验报告（含试剂信息、方法步骤、结果判读等）

5、可选增值服务：髓鞘完整性评分、脱髓鞘病灶识别与面积测量、髓鞘厚度评估、Kono/Bracken等脱髓鞘模型评分系统分析报告，髓鞘面积占比定量测量，以及髓鞘分离定量、银染轴突-髓鞘复合染色等联合分析。
       服务周期：7-10个工作日

六、应用领域

1、脱髓鞘疾病诊断：多发性硬化（MS）、视神经脊髓炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）等髓鞘损伤评估。

2、脊髓损伤研究：评估损伤后的轴突脱髓鞘程度、再髓鞘化趋势及再生效果。

3、脑缺血再灌注损伤模型：检测白质区域的髓鞘破坏、丢失、修复动态，反映脑白质病变程度。

4、神经退行性疾病：阿尔茨海默病、帕金森病等白质脱髓鞘变化的半定量评估。

5、周围神经病变：坐骨神经、外周神经的髓鞘形态、脱髓鞘和再髓鞘化过程显示。

6、药物安全性评价与药效学：评估候选神经保护药、免疫调节药物、基因治疗策略后的髓鞘修复效果。

7、基础神经科学研究：脑发育过程中髓鞘形成的时空分布观察；神经元-胶质细胞相互作用分析。

8、模型验证：LFB染色与焦油紫联合使用可区分髓鞘（蓝色）与神经元胞体（紫红），辅助模型构建评估。

七、常见问题（FAQ）

Q1：LFB染色的本质是什么？为什么多发性硬化研究用它评估髓鞘？

A：LFB染色通过铜酞菁染料与髓鞘磷脂的特异性酸-碱反应组织切片结合，染色后正常髓鞘结构呈亮蓝色至深蓝色。在多发性硬化病变中，髓鞘丢失、结构稀疏、呈淡蓝色或无蓝色区域；而在髓鞘崩解或脂滴形成中期LFB显色变浅，可通过脂染色进一步辅助识别；在晚期形成的空洞则无阳性染色区。此项技术已广泛应用MS、EAE模型、脑缺血、脊髓损伤等脱髓鞘病理过程中观察髓鞘病理程度分级评估。

Q2：LFB染色为什么需要加热过夜？时间控制对结果有何影响？

A：LFB染液中染剂颗粒较大且需充分接近髓鞘脂质配体，需要高温和较长时间以实现充分结合。常用的染色条件包括60℃烘箱中加热8-16 h；也可采用37℃过夜或室温24 h。若染色时间过短，染料无法完全渗透至深部白质区域，会造成髓鞘染色过浅、部分脱失；时间过长则增加不必要的背景染色和后续分化难度。建议对固定条件不佳的样本适当增加染色时长。

Q3：分化为核心操作难点，如何准确判断分化终点？

A：分化过程分为碳酸锂和酒精两个阶段。分化不足会导致背景过深、灰白质对比不清晰；分化过度则蓝色髓鞘脱失造成假阴性结果。核心操作技巧如下——碳酸锂分化10-30 s后可提至显微镜下观察，当灰质区域逐渐褪色、背景只呈淡灰色时，就可转入70%酒精阶段；显微镜下每分化数下就镜检判断，反复调整直至灰质区域清晰无色、白质染色鲜明为止。整个过程确保碳酸锂和酒精两种分化试剂切换得当，是保证染色质量的关键。

Q4：复染焦油紫和伊红如何选择？

A：LFB染色后可选两种复染方案——焦油紫：可同时显示神经元胞体的尼氏体，适用于评估脱髓鞘区域与神经元存活之间的关系，结合后髓鞘呈蓝色，神经元胞体呈紫色；伊红：染色简单，结果鲜明（蓝红对比），适用于快速评估髓鞘完整性后将髓鞘与其他组织区分开来。

Q5：LFB染色结果很淡或完全不着色怎么办？

A：可能原因包括：① LFB染液过期或保存不当失效——更换新鲜染液；② 固定不充分导致脂质流失，髓鞘抗原损坏——规范固定流程，用4%多聚甲醛固定24-48 h；③ 染色温度偏低或时间不足——严格维持60℃烘箱环境，适当延长染色时间；④ 分化过度，蓝色髓鞘被洗脱——若分化过度，可将切片重新放入LFB染液中再染8-16 h后重新分化。

Q6：背景染色过深、灰白质区分不清晰怎么解决？

A：背景过深通常是分化不充分所致。处理步骤：① 重新将切片放入碳酸锂溶液30 s；② 转入70%酒精分化，每分化15-30 s后镜检一次，逐步延长酒精分化时间直至灰质背景褪至无色、但白质仍保持鲜明蓝色为止；③ 如果分化过深须返回染色步骤，重入LFB染色液中重新复染。另外注意染色前切片若脱蜡不彻底也会造成染色不均匀，建议严格进行完整的脱蜡前处理。

Q7：LFB染色能保存多久？封片后如何保存？

A：染色完成后，不宜在水中长时间浸泡会导致褪色。用水性封固剂封片后，应在显微镜下尽快观察和图像采集。长期保存时需于室温或4℃于无光照、干燥环境下静置保存，避免重物压片。推荐在封固后一周内完成图像采集和数据定量分析。