一、服务概况

嘉美生物油红O染色是一种特异性显示中性脂质（甘油三酯、胆固醇酯等）的经典组织化学方法，广泛应用于动脉粥样硬化、脂肪肝、肥胖、代谢综合征及脂质沉积病等研究领域。由于观察性更好、染色更为鲜明，目前已广泛替代了苏丹III、苏丹IV等其他脂质染色法，成为检测组织和细胞内脂质分布的“金标准”方法。该方法操作简便、对比度高，适用于冰冻组织切片和细胞爬片等多种样本类型。

二、技术原理

1. 油红O是一种脂溶性偶氮染料，具有很强的脂溶剂和染脂剂特性，能特异性地与组织和细胞内的中性甘油三酯、脂质以及脂蛋白结合，使脂肪呈现出鲜艳的红色。其染色原理基于物理上的溶液作用或吸附作用——染料在组织细胞内的脂质中溶解度高于其在原溶剂中的溶解度，因此当切片浸入油红O染液时，染料便从有机溶剂中转移入脂质，从而使脂滴显色。油红O较易与甘油三酯结合，与磷脂结合力稍差。

2. 结果判读：脂滴呈橙红色至鲜红色，细胞核（经苏木素复染）呈浅蓝色，二者形成鲜明对比，便于镜下观察和定量分析。

三、服务流程与技术路线

由于脂质在常规石蜡包埋过程中会被有机溶剂（二甲苯、乙醇）溶解，油红O染色必须在冰冻切片上进行。标准流程如下：

1. 冰冻切片制备：组织OCT包埋，-20℃冷冻切片（厚度6–10 μm），贴附于防脱载玻片

2. 晾干：切片空气中干燥10–15分钟（禁止加热或提前固定）

3. 预分化：浸入60%异丙醇1–2分钟，去除水分、增强染料渗透

4. 染色：浸入新鲜过滤的油红O工作液（避光染色10–15分钟）

5. 分色/分化：60%异丙醇快速分化数秒至背景清晰

6. 漂洗：蒸馏水轻柔漂洗2–3次

7. 复染：Mayer苏木素复染细胞核（1–2分钟），盐酸酒精分化，自来水返蓝

8. 封片：水性封片剂（甘油明胶等）封片（严禁使用含二甲苯的树脂类封片剂）

时间优化：脂肪肝样本可缩短至5–10分钟，动脉斑块样本可延长至20分钟。工作液配制后须过滤使用，且需在2小时内用完，否则染料会析出失效。

四、服务说明与样本要求

1. 组织样本（新鲜）：离体后快速冷冻切片，或4%多聚甲醛/10%中性福尔马林固定4–24小时（4℃）后制作冰冻切片；严禁使用含乙醇的固定液；干冰运输，-80℃保存

2. 组织样本（已固定冰冻切片）：切片厚度6–10 μm，-20℃运输，避光保存；若需做自体荧光检测，须用锡箔纸包裹避光处理

3. 细胞爬片/涂片：4%多聚甲醛固定15–30分钟，PBS洗涤后送检；4℃运输和保存

4. 整体胚胎/器官：4%多聚甲醛固定后，蔗糖脱水沉底，OCT包埋后整体染色

样本提醒：① 固定时间不宜过长（建议不超过24小时），否则脂质可能硬化或流失；② 样本放置于20倍样本体积的固定液中固定24小时以上，切勿冷冻结冰；③ 脂质易溶于有机溶剂，严禁石蜡包埋处理；④ 若样本具有潜在传染性或致病性，请务必提前告知服务商。

五、交付内容

1. 油红O染色成品冰冻切片或细胞爬片

2. 高清数字图像或全切片扫描图像

3. 完整实验报告（含所用试剂/仪器信息、方法步骤、染色结果判读等）

4. 可选增值服务：脂滴面积定量分析（ImageJ软件）、吸光度半定量检测（异丙醇提取法，波长约510–520 nm）、脂肪变性程度分级评估

六、应用领域

1. 代谢性疾病研究：非酒精性脂肪肝模型评估、肥胖及代谢综合征模型脂肪组织观察、白色脂肪与棕色脂肪鉴别（棕色脂肪为多房性小脂滴）

2. 心血管疾病研究：动脉粥样硬化斑块中脂质核心显示、泡沫细胞和细胞外脂质可视化

3. 细胞生物学研究：3T3-L1前脂肪细胞分化诱导评估、成脂分化效率鉴定；巨噬细胞泡沫化过程观察

4. 病理学诊断：脂肪栓塞检测、脂肪肉瘤辅助诊断、脂质沉积性疾病鉴别

5. 毒理学与药学研究：药物肝毒性评估、调脂药物功效评价

6. 发育生物学：小鼠胚胎整体染色显示脂肪组织发育分布、斑马鱼等模式生物脂肪代谢表型分析

七、常见问题（FAQ）

Q1：油红O染色为什么必须使用冰冻切片，不能用石蜡切片？

A：由于脂质（中性甘油三酯、胆固醇酯等）易溶于有机溶剂，常规石蜡包埋过程中的梯度酒精脱水和二甲苯透明步骤会将脂质完全溶解，导致无法显示脂滴结构。因此，油红O染色必须在冰冻切片上进行。组织取材后应直接用OCT包埋、冷冻切片，严禁使用含乙醇的固定液。

Q2：油红O工作液为什么必须过滤？不过滤会有什么后果？

A：油红O工作液通常为储存液与蒸馏水按比例混合（如3:2），混合后染料处于过饱和状态，会形成沉淀颗粒。不过滤直接染色，显微镜下将观察到大量红色沉淀颗粒附着于组织表面和背景中，严重干扰对真实脂滴的判断。操作要点：混合后静置10–20分钟，用0.22 μm滤膜或滤纸过滤后使用，去除沉淀颗粒。

Q3：染色后封片时为什么不能使用含二甲苯的树脂封片剂？

A：二甲苯是强有机溶剂，会溶解脂滴和油红O染料，导致染色褪色甚至完全消失。必须使用水性封片剂，如甘油明胶、Aquamount等。同理，染色后脱水环节也需谨慎，避免长时间在酒精中浸泡。

Q4：固定时间过长或使用含酒精的固定液会有什么影响？

A：固定时间过长（超过24小时）会导致脂质硬化或流失，染色效果显著下降。严禁使用含酒精的固定液（如75%乙醇），因为乙醇也会溶解脂质。推荐固定液为4%多聚甲醛（PFA）或10%中性福尔马林，固定4–24小时（4℃）。

Q5：染色后背景过深、非特异性着色严重，怎么办？

A：背景过深通常有两种原因：一是油红O工作液未经过滤，沉淀颗粒附着所致；二是分化步骤时间不足，未能洗去多余浮色。解决方案：① 染色前务必过滤工作液；② 染色后浸入60%异丙醇快速分化，时间控制在数秒至背景清晰为止；③ 分化后立即用蒸馏水轻柔漂洗终止反应。

Q6：脂滴染色很淡或不着色，可能是什么原因？

A：可能原因包括：① 样本固定时间过长，脂质流失严重；② 染色时间不足（可延长至20分钟）；③ 工作液放置过久失效（工作液需在2小时内用完）；④ 染液与蒸馏水配比不当导致染料溶解度异常；⑤ 样本本身脂质含量过低（可调整阳性对照验证实验体系）。

Q7：油红O染色结果如何定量分析？

A：油红O染色支持多种定量或半定量分析方法：① 图片形态学定量：拍摄染色图片后，用ImageJ软件分析脂滴阳性区域面积占比、脂滴数目和大小；② 分光光度定量：将染色后的染料用异丙醇从样本中提取出来，在510–520 nm波长下测定吸光度值，吸光度与脂质含量成正比。两种方法可根据实验需求单独或组合使用。

Q8：细胞样本如何染色？与组织样本有何区别？

A：细胞染色流程更简单：细胞经4%多聚甲醛固定15–30分钟后，PBS洗涤3次，加入油红O工作液避光染色，组织样本为10–15分钟，细胞样本为1–2小时。染色后异丙醇漂洗去除多余染料，即可镜下观察。细胞染色时间更长，是因为细胞样本通常以爬片或多孔板形式存在，脂滴相对更小，需要更长的孵育时间才能充分着色。

Q9：组织样本送样前需要先切片还是先固定？

A：油红O染色的标准顺序是：先固定组织，再切片，最后染色。具体流程为：取新鲜组织→4%多聚甲醛固定4–24小时→蔗糖脱水→OCT包埋→冷冻切片→染色。取材后不宜直接冷冻切片，因为未经固定的组织在切片过程中胞内脂滴容易破裂或变形。

Q10：油红O染色后样本能保存多久？如何保存？

A：封片后建议尽快镜检和拍照，长期保存时油红O染色会有一定程度的褪色。如需短期保存，应置于4℃避光环境中，水性封片剂完全凝固后可保存数周。不建议带染液长时间封存。如需保存脂质样本形态进行后续研究，推荐实验结束后立即拍照存档。