一、服务概况

嘉美生物番红固绿染色（Safranin O-Fast Green Staining）是一种经典的双色组织学染色技术，适用于动物软骨/骨组织及植物组织切片染色，通过两种染料的联合应用，使软骨（或木质化组织）呈红色、骨及胶原组织（或纤维素组织）呈绿色，形成鲜明的对比效果。该染色方法始于20世纪60年代，技术成熟、操作简便、染色清晰，是骨科学研究中最常用的软骨染色方法，也是高等植物根、茎、叶组织常规制片中最广泛的染色手段，在骨科新药研发、再生医学和植物解剖学研究中发挥着不可或缺的作用。

二、技术原理

番红固绿染色基于阴阳离子染料与组织成分之间的电荷相互作用，实现对不同组织的精准区分。两种染料的性质及应用差异如下：

1、番红O (Safranin O) ：碱性阳离子染料；与组织中的阴离子基团（硫酸软骨素、硫酸角质素等）结合。动物组织嗜碱性软骨，红色/橙红色；植物组织木质化、木栓化细胞壁、细胞核，红色/红褐色。

2、固绿FCF (Fast Green FCF)：酸性阴离子染料；与组织中带正电荷的成分（胶原纤维等）结合。动物组织嗜酸性骨组织：绿色/蓝绿色；植物组织纤维素细胞壁、细胞质，绿色/蓝绿色。

特别说明：番红O着色深浅与阴离子浓度近似成正比，可间接反映软骨基质中蛋白多糖的含量和分布；当软骨损伤时，番红O常出现淡染或不着色。固绿与胶原纤维结合后不易褪色。

三、服务流程与技术路线

不同应用场景的染色时间存在差异，具体时间需根据材料种类和切片厚度进行调整。

（一）动物软骨/骨组织流程（以石蜡切片为例）

① 脱蜡至水：二甲苯脱蜡→梯度乙醇水化至蒸馏水，约45-50 min。

② Weigert铁苏木素染核：新鲜配制染液 3-5 min。

③ 流水冲洗：去除多余染液，约2 min。

④ 酸性分化液分化：去除背景染色，约15 s。

⑤ 蒸馏水洗：约10 min。

⑥ 固绿染色：酸性染料与胶原纤维结合，5-10 min。

⑦ 弱酸溶液洗涤：去除残留固绿，10-15 s。

⑧ 番红O染色：阳离子染料与软骨蛋白多糖结合 5 min。

⑨ 脱水透明封片：乙醇脱水→二甲苯透明→中性树胶封片。

特别说明：对于番红染色较浅的问题，可延长染色时间；若红色过淡甚至全部绿色，通常为番红染色不足或脱色过度，需增加番红染色时长或调整脱色步骤。

（二）植物组织流程（以石蜡切片为例）

① 脱蜡至水：70℃烤片→二甲苯脱蜡→梯度乙醇水化，约45-50 min。

② 番红染色：1%番红染液加盖浸染，1-2 h（可用冰乙酸提高染色深度）。

③ 流水快速洗：冲洗浮色，稍洗即可。

④ 分级乙醇分化：50%→70%→80%乙醇快速过，每次3-5 s。

⑤ 固绿染色：0.5%固绿染液，30-60 s。

⑥ 快速脱水：三次无水乙醇快速脱水，每次5-10 s。

⑦ 透明封片：二甲苯透明→中性树胶封片，约5 min。

特别说明：与动物组织流程不同，植物流程采用“先番红后固绿”的顺序，且番红染色时间显著更长（植物1-2 h vs 动物5 min）。植物组织染色后，固绿在酒精中极易褪色，因此脱水步骤必须快速进行。

四、服务说明与样本要求

1、动物骨组织/软骨：10%中性福尔马林固定，骨组织需充分脱钙或采用未脱钙骨切片技术；固定时间一般24-48 h；运输时加冰袋保存。

2、植物组织（根/茎/叶）：FAA溶液固定，固定液体积至少为标本的10倍；常规石蜡包埋；常温运输，冰袋保鲜。

3、石蜡切片：切片厚度4-5 μm，常温运输保存。

4、冰冻切片：新鲜组织立即送检，干冰或液氮运输，-80℃保存。

5、细胞爬片：4%多聚甲醛固定15 min，PBS覆盖，4℃运输。

样本说明：①骨组织样本需提前说明脱钙需求，未脱钙骨需采用专门的硬组织切片技术；②植物样本需明确根、茎、叶等具体部位，切片方向（横切/纵切）需提前确认；③番红染色时间需根据材料种类和切片厚度灵活调整；④固定时间过长或过短都会影响染色效果。

五、交付内容

1、番红固绿染色成品玻片（石蜡/冰冻切片）

2、石蜡蜡块

3、高清数字图像（常规每张切片提供1-3张代表性图像）或全切片扫描图像

4、完整实验报告（含所用试剂、仪器、方法步骤等）

服务周期：7-10个工作日

六、应用领域

1、骨关节炎研究：评估关节软骨退变程度、监测软骨修复效果；番红O着色深浅可反映蛋白多糖含量变化。

2、骨科新药研发：评价药物对软骨保护和骨再生能力，观察骨痂形成、骨折愈合过程。

3、骨质疏松研究：观察骨小梁微结构变化及骨量丢失情况。

4、组织工程与再生医学：评估干细胞或支架材料在体内诱导软骨/骨再生的效果。

5、植物解剖学研究：观察根、茎、叶等组织的木质部和韧皮部分布及其结构特征。

6、植物发育生物学：研究植物组织分化、维管束形成等发育过程。

七、常见问题（FAQ）

1、番红O着色过淡或不着色 

①软骨损伤导致蛋白多糖流失。

②番红染色时间不足——延长染色至2小时以上。

③脱色过度——调整50%乙醇分化时间。

④组织固定不当——规范取材和固定流程。

2、整体偏绿，红色缺失

①固绿染色时间过长——严格控制30-60秒，时间过长会褪去番红颜色。

②番红染色不足——增加番红染色时间。

染色不均或模糊 ①固定不充分或切片脱蜡不彻底——重新固定或延长脱蜡时间。

②脱水透明不充分——规范脱水流程。

3、染色后易褪色

①番红水洗时间过长——缩短水洗时间。

②酒精脱水时浸泡过久——动作要快，各缸快速过。

③切片存放时间过长——及时封片镜检。

4、植物切片绿色过深

固绿染色时间过长，占满整个视野导致无法区分结构——严格控制染色时间，通常30-60秒即可；若绿色过深，可用自来水短时冲洗或减少染色时间。

5、植物切片红色过淡

番红染色时间不足或脱色过度——延长番红染色至至少2小时，甚至过夜；脱色时不经过低浓度乙醇，用蒸馏水快速清洗。

6、关节软骨（动物）番红O染色不均

软骨损伤或退化导致蛋白多糖含量分布不均——需结合OARSI评分系统进行半定量评估。

7、植物染色时固绿易脱落

固绿易溶于酒精——脱水步骤须快速，无水乙醇中浸泡时间要短。

8、未脱钙骨切片番红染色效果差

酸脱钙过度导致软骨基质成分流失——控制脱钙时间，或采用未脱钙骨硬组织切片技术。