一、服务概况

嘉美生物免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）服务，是利用抗原-抗体特异性结合原理，在组织切片或细胞爬片上对特定蛋白进行定位、定性和半定量分析的技术平台。该服务兼具组织形态学观察与分子水平检测的双重优势，广泛应用于病理诊断、基础医学研究及药物研发等领域。

服务特点：

1、涵盖从样本处理、切片、染色到图像采集与分析的一站式服务。

2、配备自动化染色系统与专业病理阅片团队。

3、严格的质量控制。

4、灵活的合作模式：客户可自带一抗，或委托代购/推荐抗体。

二、技术原理

免疫组化的基本实验原理可概括为“识别-示踪-显色”三步：

1、特异性识别：一抗（primary antibody）与组织切片中目标抗原（蛋白）的特定表位结合。

2、信号放大与示踪：酶标或荧光标记的二抗（secondary antibody）与一抗结合，形成“抗原-一抗-二抗”复合物，实现信号级联放大。

3、可视化检测：酶法显色，二抗上耦联的辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）催化底物（如DAB、AEC）发生显色反应，生成不溶性有色沉淀，在明场显微镜下观察。

嘉美生物免疫组化关键质控点：抗原修复（热修复/酶修复）、封闭（减少非特异性背景）、抗体稀释度与孵育条件、显色时间精确控制。

三、服务流程

1、用户咨询：沟通研究目的、目标蛋白、样本类型及数量。

2、样本接收与处理：检查样本质量，固定、脱水、包埋；制备石蜡块。

3、切片与烤片：石蜡切片厚度通常3 – 5 μm，冰冻切片8 – 10 μm；烤片（60 ℃, 1 – 2小时）或室温干燥。

4、脱蜡、水化与抗原修复：二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；抗原修复（柠檬酸缓冲液高温修复或胰酶/蛋白酶K修复）。

5、封闭与一抗孵育：3% H₂O₂ 阻断内源性过氧化物酶（针对HRP体系）；血清/BSA封闭非特异性位点；一抗4 ℃过夜或室温1-2小时。

6、二抗孵育与显色：相应酶标二抗室温孵育30-60分钟；DAB显色（镜下控制时间）。

7、复染：苏木素复染细胞核。

8、图像采集与分析：明场，正置显微镜全景扫描或高分辨率拍照；半定量/定量分析，阳性细胞百分比、染色强度评分（如IRS、H-score）、组织评分（如CPS、TPS）。

9、出具报告：提供原始图像、分析数据、实验方法、试剂信息及质控结果。

四、服务说明与样本要求

1、可接受的样本类型

组织块：新鲜组织用4%多聚甲醛或10%中性福尔马林固定24-48小时；体积建议 ≤ 1.5×1.5×0.5 cm，送检前请勿冻结或干涸。

石蜡块：已包埋完整，无裂痕，保存良好，可附带HE染色参考片。

切片（已贴片）：石蜡或冰冻切片，建议使用防脱玻片，需注明修复方式（若已知）。

细胞爬片/细胞涂片：4%多聚甲醛固定15-30分钟，PBS清洗后4℃湿盒保存，细胞密度适宜。

2、服务说明

抗体相关：客户可提供已验证的有效一抗（说明书需一同交付）；也可委托服务商代为筛选或购买市售抗体（推荐品牌如Abcam、CST、Santa Cruz等）。

数据分析等级：基础，形态描述与代表性图像。

3、服务承诺与周期

标准周期：从收到合格样本起，常规IHC约7-10个工作日。

加急服务：可协商（额外费用）。

质控标准：每批实验包含阳性对照组织切片及不加一抗的阴性对照。

五、交付内容

项目完成后，客户将获得以下完整交付物：

1、原始染色玻片：全部已完成染色的组织切片，长期保存。

2、包埋好的石蜡块。

3、高分辨率数字图像：明场，整张扫描或三个视野区域拍照。

4、原始实验记录：包括抗体信息（克隆号、稀释度、批号）、修复方法、孵育条件、显色时间等。

5、详细实验方法（Methods）：可直接用于论文材料与方法部分的撰写模板。

六、应用领域

1、临床病理诊断

肿瘤鉴别：确定来源不明的转移瘤（如CK7、CK20、TTF-1）。

淋巴瘤分型：CD3、CD20、CD30、MUM1等。

预后评估：Ki-67增殖指数、p53突变模式、c-Myc/Bcl-2双表达等。

2、伴随诊断与精准治疗

乳腺癌：ER、PR、HER2（需符合ASCO/CAP指南评分）。

非小细胞肺癌：PD-L1表达（22C3/SP263等克隆）、ALK重排辅助诊断。

免疫治疗：肿瘤组织PD-L1、MSI状态、TILs评估。

3、基础医学研究

发育生物学：组织器官形成过程中标志蛋白的时空表达。

信号通路：检测磷酸化蛋白（如p-AKT、p-ERK）在原位组织中的激活状态。

神经科学：神经元特异性标记（NeuN、GFAP）、突触蛋白定位。

4、药物研发与毒理评估

靶点占据研究：用药后动物模型中药物靶蛋白的表达变化。

药效生物标志物：如凋亡标志物（Cleaved Caspase-3）、增殖标志物（BrdU共定位）。

安全性评价：检测药物在组织中的蓄积或诱导的蛋白表达改变（如CYP450酶）。

5、传染病与微生物研究

病毒蛋白定位：EBER原位杂交、HBV表面抗原/核心抗原。

病原体与宿主相互作用：分支杆菌、幽门螺杆菌等。

七、常见问题（FAQ）

Q1：固定不充分或固定时间过长会有什么影响？

A：固定不足会导致抗原弥散、自溶；固定过久（>72小时）会过度交联抗原表位，导致信号减弱或丢失。建议新鲜组织4%多聚甲醛固定24-48小时。

Q2：客户可以提供自己的抗体吗？有什么要求？

A：可以。请提供抗体说明书（知晓种属、应用（IHC已验证）、推荐稀释度），同时提供一小份用于预实验。若抗体未经验证，服务商会用阳性对照组织先行测试。

Q3：什么是抗原修复？为什么要做？

A：福尔马林固定会使蛋白质之间形成亚甲基交联，掩盖抗原表位。通过加热（微波/高压）或酶消化（蛋白酶K）可“暴露”表位，极大提高染色灵敏度。绝大多数石蜡切片必须进行抗原修复。

Q4：如何判断染色结果是真实的阳性还是背景？

A：背景通常表现为弥漫性、非细胞特异性的浅棕色或非结构区域的荧光。阳性信号应为特定细胞区室（膜/浆/核）的清晰定位。每批实验的阴性对照（不加一抗）若出现明显信号，则整批结果不可信。

Q5：一个组织可以同时检测几种蛋白？

A：取决于技术平台：

常规荧光双标：2种（需种属不同或直接偶联抗体）。

多重免疫组化（TSA法）：理论上可检测7种以上，常用3–5色。

酶法多标（不同显色底物）：最多2-3种，且难同时定量。

Q6：冰冻切片与石蜡切片结果为何有差异？

A：冰冻切片保留完整抗原活性，无需修复，染色信号通常更强且背景更低；但形态细节较差，且部分抗原在OCT包埋中可能受影响。石蜡切片形态清晰，适合长期保存和回顾性研究，但需要抗原修复。

Q7：你们能提供组织芯片制备服务吗？最低多少个芯点？

A：可以。通常最低要求20个芯点，双芯可重复。接受蜡块捐赠或新鲜组织委托制备，需额外收取打孔与阵列包埋费用。

Q8：如何解读Ki-67增殖指数？

A：在阳性热点区（hot spot）计数至少500个肿瘤细胞，计算核染色阳性百分比。不同肿瘤阈值不同（如乳腺癌20%作为高风险切点）。报告中将给出原始计数区域及比例。

Q9：如果染色结果不理想，是否有补救措施？

A：可在同一蜡块上重切重染；对于已有切片的非关键步骤失误（如显色过浅），可尝试增加抗原修复强度或更换检测体系。若为抗体问题，需重新购买或更换克隆号。

Q10：提供的数据可以用于发表文章吗？

A：可以。我们提供符合期刊要求的图像格式（TIFF，≥300 DPI）及详细实验方法描述。如有需要，可额外提供原始未压缩文件和未裁剪的全图，并协助出具方法学复现声明。