一、服务概况

嘉美生物流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行快速定量分析和分选的高通量检测手段，集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，可定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等重要参数。该服务在免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、药物学等领域的基础研究与临床检测中广泛应用，主要涵盖细胞表面标志物检测、淋巴细胞亚群检测、细胞周期分析、细胞凋亡检测、细胞杀伤检测等内容。

二、技术原理

流式细胞术基于流体动力学聚焦和激光检测原理。细胞在流动室中包裹在鞘液内排列成单列，一个一个迅速通过激光聚焦区。当激光照射到每个细胞时，产生两种类型的光信号：散射光（包括前向角散射FSC——反映细胞大小，侧向角散射SSC——反映细胞内颗粒复杂程度）和激发荧光。通过荧光标记的特异性抗体或染料识别细胞表面或内部的特定分子，将荧光信号转化为电信号，从而获得细胞的物理特征和生物学参数。

三、服务流程与技术路线

1、实验设计：客户提交流式细胞检测请求与实验要求，与嘉美生物商定具体的实验项目、数量和费用，签订服务合同。

2、样本接收与细胞处理：客户提供检测样品，实验室将组织或血液等样本制备成单细胞悬液，进行细胞计数和活力检测。

3、荧光标记：加入荧光标记的抗体或染料进行标记，通常室温避光染色15分钟或4℃冷藏染色30分钟。

4、流式细胞仪上机检测：染色后的样品上机检测和分析。

5、数据分析：对获取的细胞数据进行去粘连、圈门、补偿调节等分析处理。

6、报告出具：1-2周内提交检测报告和数据。

四、服务说明与样本要求

1、细胞样本：单细胞悬浮状态，细胞数量≥1×10⁶～1×10⁷个，活率95%以上，生长良好无污染；样本需低温保存运输，切勿冷冻；细胞应该生长良好，无污染，同时提供阴性对照样品。

2、外周血：EDTA或肝素抗凝全血，4-8mL；24小时内采集，无对人体有害的病原体污染；样本需低温保存运输，切勿冷冻，4℃运输。

3、新鲜组织（脾/胸腺/淋巴结）：2小时内采集的新鲜组织，离体后置入PBS/培养基内，尽快制成单细胞悬液，4℃低温运输。
       4、荧光一抗客户提供，也可由嘉美生物代买。

五、交付内容

1、流式细胞实验原始数据文件（FCS格式）

2、高清散点图、直方图、密度图等数据分析图片

3、详细检测报告（含细胞分群比例、亚群拟合图、门控策略说明等）

4、电子版流式检测报告文件和相关图表说明

六、应用领域

1、免疫细胞分型：T细胞（CD3+、CD4+、CD8+）、B细胞（CD19+）、NK细胞（CD56+）、单核/巨噬细胞等免疫细胞亚群分类及计数。

2、细胞周期分析：PI/RNase染色检测细胞DNA含量，测定细胞周期各阶段（G0/G1、S、G2/M期）分布比例。

3、细胞凋亡检测：Annexin V/PI双染法鉴别活细胞、早期凋亡、晚期凋亡及坏死细胞群。

4、干细胞标志物分析：鉴定和定量干细胞表面标志物（CD34、CD133、CD117等）。

5、胞内因子与信号通路检测：通过破膜处理检测IFN-γ、IL-4等细胞因子，及信号蛋白磷酸化水平。

6、细胞增殖与杀伤试验：CFSE染料追踪细胞增殖、CFSE/PI联合检测免疫细胞杀伤效率。

7、DNA倍体与肿瘤诊断：白血病/淋巴瘤免疫分型、HLA-B27表型分析等临床诊断。

七、常见问题（FAQ）

Q1：流式细胞检测与Western Blot有什么区别？

A：①Western Blot可以检测多种类型的蛋白，而流式主要适用于检测膜蛋白，且抗体通常是直接与荧光基团相连；②Western Blot对抗体需求量较少（一般1:1000左右稀释），而流式对抗体的需要量较大（一般1:50左右）；③流式可以获知表达目的抗原的细胞占比情况，而Western只能比较样本间平均表达水平。

Q2：流式细胞检测时为什么要设置多种对照？

A：关键的对照设置包括：①空白对照——排除细胞自发荧光的干扰；②同型对照——排除抗体Fc段与细胞表面Fc受体的非特异性结合；③补偿对照（单阳对照） ——在不同荧光通道之间有光谱重叠时，需设置单染管进行荧光补偿。

Q3：荧光补偿的作用是什么？补偿设置不准确会有什么影响？

A：在多色流式分析中，不同荧光染料的发射光谱会相互重叠，导致荧光信号的交叉干扰。通过设置单色阳性对照进行补偿调节，可准确扣除其他荧光通道中的本底干扰。补偿设置不正确会导致实验结果出现假阳性或假阴性，可通过补偿微球简化补偿调节过程。

Q4：客户提供抗体时有什么要求？

A：客户可以提供自备抗体，要求抗体质量可靠，货期稳定，且应与样本发生特异性识别反应。同时需提供抗体货号及厂家信息、抗体信息表、靶蛋白背景资料和推荐的实验方案。客户也可委托服务商代购指定品牌和规格的抗体。服务商可提供Annexin V/PI检测试剂盒等常用试剂。对于部分通用荧光染料（如PI、DAPI、7-AAD等），很多服务商可免费提供。细胞周期检测通常需额外收取试剂费用（如PI/RNase染料等）。

Q5：流式细胞检测的实验周期是多久？

A：常规流式细胞检测包括细胞周期分析、细胞凋亡检测、淋巴细胞亚群分析等的出报告时间为1-7个工作日；干细胞或复杂多色Panel分析一般为1个月以上。

Q6：染色后的细胞不能马上检测该如何保存？

A：如果抗体染色后不能尽快上机，可以放在冰上避光保存最长24小时。若短时间内无法上机检测，可选择使用2%多聚甲醛进行固定，固定后放于4℃保存一般可保持2天左右，但固定后的细胞形态可能发生一定变化，可能影响FSC/SSC图中各细胞群的位置。

Q7：做细胞周期检测时，如何排除粘连细胞干扰？

A：粘连细胞会使DNA含量加倍，干扰细胞周期的准确性分析。可通过FL2-W (脉冲宽度) 和FL2-A (脉冲高度) 双参数进行粘连细胞的识别与排除。通常只有单细胞会位于FL2-A/FL2-W图的斜线区域内，粘连细胞会偏离主要细胞群，可通过门控策略加以排除。此外，在样本制备时注意控制细胞密度，上机前用200目滤网过滤也是减少粘连细胞的重要措施。

Q8：上机检测时细胞数要求是多少？

A：为得到能够进行统计学分析的数据，通常有效细胞的信号需在15000以上。对于多层次圈门比例极小的细胞群，建议最少的目标细胞群在500个以上。