一、服务概况

嘉美生物蛋白免疫印迹（Western Blot, WB）是一种基于蛋白质电泳分离、膜转移及特异性抗体识别的分子生物学技术，用于检测特定蛋白的表达水平与分子量大小。该技术结合了SDS-PAGE的高分辨力与固相免疫测定的高特异性和敏感性，是蛋白分析的常规技术之一。WB服务适用于组织、细胞、血液、细菌及植物等多种样本类型，主要提供蛋白提取、定量、电泳、转膜、抗体孵育及信号检测的全流程技术服务。

二、技术原理

WB基于三个核心步骤实现蛋白检测：电泳分离——在SDS和还原剂存在下，蛋白质变性并均匀带上负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电场中按分子量大小进行分离（小分子蛋白迁移快，大分子慢）；膜转移——将分离后的蛋白从凝胶转移至PVDF膜或NC膜上，以利于后续免疫检测；免疫检测——通过特异性一抗识别靶蛋白，再用标记HRP或荧光基团的二抗结合，通过化学发光或荧光成像完成可视化检测。

三、服务流程与技术路线

① 蛋白提取：从细胞、组织等样本中提取总蛋白或亚细胞蛋白（核/浆/膜蛋白），添加蛋白酶抑制剂防止降解。

② 蛋白定量：BCA法或Bradford法精确定量总蛋白浓度，确保上样量一致性。

③ 电泳（SDS-PAGE）：按靶分子量选择适宜凝胶浓度（8%-15%），上样后电泳分离蛋白。

④ 转膜：湿转法或半干转法将蛋白转移至PVDF/NC膜，丽春红染色验证转膜效率。

⑤ 封闭：5%脱脂奶粉或BSA室温孵育1-2小时，减少非特异性结合。

⑥ 一抗孵育：靶蛋白特异性一抗孵育膜，通常4℃过夜或室温数小时 过夜或数小时。

⑦ 二抗孵育：HRP标记二抗室温孵育1小时，结合一抗。

⑧ 信号检测：ECL化学发光显影（X胶片/成像系统捕获），可选荧光检测。

⑨ 数据分析：目的蛋白条带灰度值以内参校正，得出蛋白相对表达量。

四、服务说明与样本要求

1、细胞样本：＞1×10⁷个/样，PBS清洗后收集沉淀，液氮速冻后-80℃保存，干冰运输

2、组织样本：＞100-500mg/样，新鲜组织离体后尽快液氮速冻，-80℃保存，干冰运输

3、蛋白样本：总蛋白量＞200±g/样，浓度＞1mg/ml，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融

4、血液/血清：血清＞50±l/样，-80℃保存，干冰运输

5、一抗：由客户提供（注明种属、来源、推荐稀释度及靶蛋白背景资料），也可委托嘉美生物代购

6、阳性对照：建议提供已知阳性表达样本（纯蛋白、阳性表达细胞/组织或商品化对照），用于实验体系质控

特殊提醒：磷酸化蛋白检测需在1个月内完成，长期保存易去磷酸化导致检测失败。

五、交付内容

1、蛋白提取与定量报告（含总蛋白浓度及质控数据）

2、WB原始图片（X胶片扫描图或化学发光成像图，TIFF/JPEG/PNG格式）

3、完整实验报告（含实验方法、试剂信息、抗体来源及稀释度、仪器参数等）

4、灰度值分析数据及统计图表（可选，含目的蛋白/内参校正值及作图）

5、剩余样本和一抗

6、免费内参：嘉美生物免费提供β-actin、GAPDH、β-tubulin等常规内参检测

服务周期：14-21个工作日。

六、应用领域

1、蛋白表达定量：检测不同处理条件下（药物处理、基因敲除/过表达、疾病模型等）目标蛋白的表达差异。

2、蛋白分子量鉴定：验证蛋白是否发生降解、剪切或聚合，确认蛋白完整性。

3、翻译后修饰研究：磷酸化、乙酰化、泛素化等修饰水平的检测。

4、抗体特异性验证：检验抗体能否特异性识别目标蛋白，排除交叉反应。

5、蛋白-蛋白相互作用：结合免疫沉淀（IP）进行Co-IP-WB分析。

6、疾病标志物筛选：肿瘤、神经退行性疾病等样本中候选标志物的表达验证。

7、药物靶点验证：药物处理后靶蛋白表达水平或活性的变化评估。

8、重组蛋白表达鉴定：验证原核/真核表达系统中重组蛋白是否正确表达。

七、常见问题（FAQ）

Q1：无阳性条带或信号很弱，可能的原因有哪些？

A：主要原因包括：① 蛋白降解——样本反复冻融或未添加蛋白酶抑制剂，建议使用新鲜样本并全程冰上操作；② 上样量不足——蛋白浓度测定有误导致上样蛋白总量偏低，可适当提高上样量；③ 抗体问题——一抗失效（反复冻融、储存不当）或稀释比例不合理；④ 转膜效率低——可用丽春红染色验证转膜是否成功；⑤ 曝光时间不足——适当延长ECL曝光时间。

Q2：出现多条非特异性条带或条带位置与预期不符怎么办？

A：多条带可能原因：① 抗体特异性不足——使用单克隆抗体或在目的蛋白高表达样本中验证条带特异性，可通过RNAi敲低验证靶条带是否消失；② 蛋白降解——样品中可能存在蛋白酶活性；③ 蛋白修饰——如糖基化、磷酸化导致分子量偏移；④ 上样量过高——减少总蛋白上样量。建议查阅文献对抗体识别的预期条带模式进行确认。

Q3：背景过高、图像不干净，如何解决？

A：背景过深主要源于封闭不充分或洗涤不彻底。建议：① 延长封闭时间或更换封闭液（如从脱脂奶粉换为BSA）；② 严格按流程进行洗涤（TBST/TBS，每次5-10分钟，至少3次）；③ 二抗孵育后充分洗涤；④ 检测所用设备是否干净，避免污染。

Q4：组织、细胞样本的送样量要求是多少？如何保存和运输？

A：组织样本一般需要100-500mg新鲜或冻存组织；细胞样本通常需要＞1×10⁷个细胞；蛋白样本需总蛋白>200μg。所有样本应于-80℃保存，干冰运输，切忌反复冻融。

Q5：内参蛋白该如何选择？为什么要选与目的蛋白分子量相差5KD以上的内参？

A：常见内参包括β-actin（42 kDa）、GAPDH（37 kDa）、β-tubulin（55 kDa）等。选择时务必保证内参蛋白与目的蛋白分子量相差5 kDa以上，否则内参条带可能干扰目的条带的判读。如果目的蛋白分子量为45 kDa，则不宜选择β-actin（43 kDa）作为内参。GAPDH在活组织中表达稳定，适合多组织样本对比；β-actin和β-tubulin是结构蛋白，不同组织表达可能存在差异。

Q6：客户可以自己提供一抗吗？有什么要求？

A：可以。客户需提供一抗并注明以下信息：抗体种属来源（如rabbit/mouse）、推荐稀释比、靶蛋白分子量及参考文献中已确认的应用（如WB已验证）。建议优先使用进口单克隆抗体（如Cell Signaling Technology、Abcam、Jiamay等）。嘉美生物会根据预实验结果确认最佳稀释度。

Q7：什么叫阳性对照？为什么要提供？

A：阳性对照指已知表达目的蛋白的样本（如特定细胞系、过表达裂解液或商品化阳性对照），用于验证实验体系是否正常工作。如果阳性对照呈阴性，说明实验体系存在问题（如抗体失效、试剂失活），需排查后再检测待测样本。建议尽量提供阳性对照，以确保结果可靠性。

Q8：预实验是做什么的？为什么需要预实验？

A：预实验采用1-3个一抗稀释度，选择部分正式实验样本先行检测，以优化实验条件——确定最佳一抗稀释比、验证样本质量、确认抗体特异性及靶蛋白分子量。预实验可有效避免因条件不当导致正式实验失败，是控制实验质量的重要环节。