一、服务概况

嘉美生物TUNEL凋亡检测是分子生物学与形态学结合的金标准方法，可在单细胞水平原位标记DNA断裂末端，精准识别凋亡细胞。适用于肿瘤研究、药物筛选、神经退行性疾病评估及胚胎发育研究等领域，检测灵敏度极高。可承接石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、细胞涂片及爬片等多种样本类型，并提供DAB显色法与荧光法两种检测方案。

二、技术原理

细胞凋亡时，DNA内切酶被激活，核小体间的DNA链断裂（产生180-200bp片段）并暴露出大量3'-OH末端。在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的催化下，荧光素（如FITC）或生物素标记的dUTP被连接至这些断裂末端。标记后的样本在荧光显微镜下可直接观察凋亡细胞（绿色荧光），生物素标记的样本还可进一步通过HRP-DAB显色在普通光学显微镜下呈现棕色信号。正常细胞因无DNA断裂信号，几乎不被染色。

三、服务流程与技术路线

1、预实验：采用阳性和阴性对照体系摸索最佳实验条件。

2、前处理：石蜡切片脱蜡至水；冰冻切片固定（4%多聚甲醛）；细胞样本4%多聚甲醛固定15-30min。

3、通透：蛋白酶K孵育，暴露DNA末端（约10-30min）。

4、标记末端：TdT酶催化，滴加荧光素或生物素标记的dUTP反应液，37℃避光孵育约60min。

5、显色（可选） ：HRP催化DAB液滴染显色呈深棕色。

6、复染（可选） ：苏木精复染，辅助定位。

7、镜检与分析：调节参数采集图像，计数凋亡细胞占总细胞的百分比。

四、服务说明与样本要求

1、组织样本（石蜡） ：活检或手术切除标本应在2小时内取材或固定，常规固定（推荐10%中性福尔马林/4%多聚甲醛，24-36h），避免组织自溶及抗原变性。建议提供不少于1×1×0.5cm的组织块。常温运输。

2、组织样本（冰冻） ：取材后立即液氮速冻，-80℃保存，干冰+少量冰袋运输（需提前沟通）。切片厚度常规为4μm。送样前建议联系嘉美生物确认样本接收标准。

3、细胞爬片/涂片：贴壁细胞或细胞沉淀尽量涂于提前用组化笔画好的区域内进行染色。每份样本至少1×10⁶个细胞，低温寄送（冰袋邮寄，防止结冰）。

注意事项：样本需完整填写种属、类型等详细信息，避免各类污染和反复冻融。送样前建议开展预实验以验证实验体系有效性。

五、交付内容

1、染色成品玻片（石蜡/冰冻切片）与石蜡蜡块（如适用）。

2、高清数字图像（DAB显色光学图像）。

3、可选增值服务：DAB染色扫描全景图像。

4、完整实验报告（含试剂信息、设备信息、方法步骤、结果判读等）。

5、剩余样本（如有要求，实验完成后归还）。

六、应用领域

1、细胞凋亡基础研究：发育生物学胚胎形态发生与稳态维持；免疫系统中免疫细胞克隆选择与自身免疫，以及感染后靶细胞的清除。

2、药物筛选与药效评价：抗肿瘤药对肿瘤细胞致死或抑制效果评价；神经保护药物对抗神经退行性疾病的药效验证；环境污染物、细菌毒素等物质对细胞活力的影响评估。

3、疾病模型病理学评估：缺血、再灌注损伤及脑卒中等情况下脑组织、心肌组织凋亡评估；肝纤维化或肾纤维化模型中检测实质细胞凋亡水平；移植物抗宿主病（GVHD）中宿主细胞凋亡及器官损伤评估。

4、基因功能与信号转导研究：基因敲除/过表达后对细胞状态改变进行验证；筛选和鉴定对细胞存活具有正负调控作用的上游信号分子及下游关键效应子。

5、医学生殖与毒理学评价：睾丸、卵巢等生殖器官毒性及生殖细胞凋亡率检测；评价环境污染物、致癌剂、化妆品等对生殖系统和胚胎发育的致畸和致凋亡效应。

6、TUNEL+免疫荧光共染研究：同一细胞样本上区分细胞死亡类型和特定分化阶段；准确鉴定不同细胞类型（如神经元、胶质细胞）中的凋亡信号。

七、常见问题（FAQ）

Q1：TUNEL染色荧光信号弱或检测不到信号，是什么原因？如何解决？

A：原因与解决方案：①固定不充分或固定液不当——首选4%多聚甲醛固定，不建议使用乙醇；②蛋白酶K孵育时间不足（常用10-30分钟）或浓度偏低（常用20μg/mL）——优化通透时间；③切片太厚（>6μm）或脱蜡不充分——减薄至4-5μm，严格脱蜡流程；④TdT酶失活或染色时间短（37℃<60min）——临用前配制反应液，延长至60分钟至2小时；⑤样本保存时间过长（-20℃失活）——使用新鲜切片制备。

Q2：全阳性、背景荧光亮或非特异性染色多，怎么处理？

A：①DNA酶对所有样本都处理了——仅对阳性对照管处理；②染色时间过长或漂洗不足——缩短时长（60分钟左右），增加漂洗次数；③血液残留或杂质残留——灌注充分、染色前清洗组织样本；④曝光或反应温度过高——降低曝光，阴性对照调节条件；⑤制备切片时高温烘干或加热——4℃平铺晾干或风干涂片；⑥操作过程中干片——保持样本湿润，中途可用PBS覆盖。

Q3：TUNEL检测必须设对照吗？如何设置？

A：必须。①阴性对照：不加TdT酶，其他步骤相同，用于排除非特异性染色及调节曝光强度。②阳性对照：单独用DNase I处理，确保染色和试剂无误，如果阳性对照信号微弱甚至为阴性，说明染色体系或试剂存在问题，需要重新优化条件。

Q4：石蜡切片可用于双染实验吗？实验顺序如何？

A：TUNEL结合免疫组化（IHC）时，固定过程对检测影响较大，切片大小和厚薄可能引起染色差异，常见TUNEL与免疫组化双染或多标记可以先用TUNEL标记凋亡，终止TUNEL反应后再进行免疫染色；也可以用IHC先检测目标蛋白、后做TUNEL荧光标记。务必在正式实验前通过仅进行TUNEL染色、仅进行IHC染色以及同时进行的双染色三组预实验来确定两种方法间的兼容性与信号淬灭程度。

Q5：TUNEL检测可以绝对定量吗？

A：可以半定量和相对定量。通过多个视野计算总细胞中TUNEL阳性细胞比例（凋亡指数/Apoptosis Index，AI）反映凋亡程度。若需要较大样本量、更精确的定量以及区分不同细胞子集的比例，常用流式细胞术结合荧光标记TUNEL和细胞表面标志物抗体（如Annexin V/PI）等多种检测途径进行定量分析。