一、服务概况

嘉美生物CCK-8检测（Cell Counting Kit-8）是一种基于WST-8的细胞增殖与毒性检测方法，广泛应用于药物筛选、基因调控及材料生物相容性评价等领域。CCK-8法被誉为“细胞增殖和毒性检测的明星方法”，可替代传统的MTT法，适用于贴壁细胞和悬浮细胞等多种样本类型，覆盖药物筛选、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验及生物因子活性检测等实验场景。该方法具有灵敏度高、数据稳定、操作简便等优点，备受青睐。

二、技术原理

CCK-8检测基于WST-8的生物还原反应。CCK-8试剂中含有水溶性四唑盐WST-8，在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下，活细胞线粒体中的脱氢酶将WST-8还原为橙黄色甲臜产物（Formazan）。细胞增殖越快，甲臜产量越多，颜色越深；药物或毒性物质导致的细胞毒性越强，细胞活力越低，甲臜产量越少，颜色越浅。

甲臜产物在450 nm波长处有特征性吸收峰，颜色深浅与活细胞数量呈线性关系，通过酶标仪测定吸光度（OD值），间接反映活细胞数量。WST-8法产生的水溶性甲臜产物，无需有机溶剂溶解，可直接测定，具有操作简便、灵敏度高、线性范围宽等优势。

三、服务流程与技术路线

① 细胞培养与接种：细胞计数后，在96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔），37℃、5% CO₂培养箱中培养。

② 药物处理：根据客户方案加入不同浓度的待测药物或毒性物质，继续培养设定时间（如24、48或72 h）。

③ 显色反应：每孔加入10 μL CCK-8溶液，混匀后培养箱中孵育1–4小时。

④ 吸光度测定：酶标仪测定450 nm处各孔的吸光值（OD值）。

⑤ 数据分析：根据OD值计算细胞活力、增殖率、抑制率及IC50（半数抑制浓度）。

⑥ 结果交付：提供原始数据、图片、分析结果及完整实验报告。

四、服务说明与样本要求

1、细胞样本（冻存）：细胞株需注明培养条件（培养基、血清浓度、传代比例等），冻存细胞需用干冰运输。

2、细胞样本（培养中）：状态良好的活细胞，用装满培养液的培养瓶寄送，瓶口用封口膜密封，常温或2-8℃运输。

3、待测药物/试剂：提供待测化合物及相关背景信息（溶解性、稳定性、保存条件等），如有文献报道可一并提供。

4、阳性对照：建议提供已知效果的药物或处理方式，用于验证实验体系。

细胞接种说明：使用标准96孔板时，贴壁细胞最小接种量至少为1000个/孔(100 μL培养基)，推荐2000-5000个/孔；白细胞因灵敏度较低，推荐接种量不低于2500个/孔。如需使用24孔板或6孔板，应按每孔培养基总体积的10%调整CCK-8用量。

五、交付内容

1、酶标仪各孔吸光值原始数据。

2、细胞活力/增殖率/抑制率分析结果及统计图表。

3、IC50（半数抑制浓度）计算结果（如有药物浓度梯度）。

4、完整实验报告（含实验方法、步骤、所用试剂及仪器信息）。

5、细胞图片（可选，如细胞形态观察）。

服务周期：7-14个工作日。

六、应用领域

1、药物筛选与活性检测：小分子化合物、多肽、中药活性成分等药物筛选及功能安全性研究。

2、细胞毒性测定：评价药物、化学试剂、医疗器械材料的细胞毒性。

3、肿瘤药敏试验：抗肿瘤药物敏感性和耐药性检测，辅助个性化用药指导。

4、基因表达调控研究：分析目的基因过表达、RNAi干扰、miRNA调控对细胞增殖活性的影响。

5、生物因子活性检测：细胞因子、蛋白抗体、生长因子等活性分子的生物活性评估。

6、细胞增殖活性测定：用于肿瘤相关研究、损伤后修复、组织再生领域的细胞增殖能力评估。

7、IC50测定：计算药物抑制细胞数量一半时的浓度（半数抑制浓度）。

七、常见问题（FAQ）

Q1：CCK-8法与传统的MTT法相比，有哪些优势？

A：CCK-8法具有以下显著优势：①甲臜产物水溶性，无需有机溶剂溶解，省去后续步骤；②灵敏度更高、稳定性更好；③对细胞无明显毒性（毒性极低），孵育后不影响细胞后续实验；④可多次反复读取OD值，检测时间更灵活；⑤操作简便，适合高通量药物筛选；⑥即开即用，毋需预制。CCK-8在灵敏度、检测速度和便利性方面全面领先于MTT法。

Q2：检测结果吸光度值偏低或几乎没有信号，可能是什么原因？如何解决？

A：吸光度值偏低常见原因及解决方案：①细胞接种量不足——增加每孔细胞数量，贴壁细胞推荐2000-5000个/孔，白细胞不低于2500个/孔；②CCK-8孵育时间不足——一般1-4小时可观察到明显显色，白细胞可能需要延长至5-6小时；③细胞状态不佳——确保细胞处于对数生长期，状态良好；④CCK-8试剂失效（颜色异常）——检查试剂颜色应为粉红色，避免反复冻融，0-5℃避光保存。预实验必不可少：建议先做几个孔摸索细胞接种密度和CCK-8最佳孵育时间。

Q3：药物或待测物质对CCK-8检测结果有干扰时，如何处理？

A：首先通过预实验确认干扰因素：在含药物的培养基中加入CCK-8测定吸光度，若OD值显著高于空白对照，说明药物干扰检测。解决方法：①更换培养基：在加CCK-8前移去旧培养基，用PBS或新培养基洗涤细胞1-2次，加入不含药物的培养基后再加CCK-8测定；②设置药物空白孔：在不含细胞的孔中加入含药物的培养基，测定该孔吸光度作为参比，在计算时扣除药物背景；③使用无酚红培养基：酚红会竞争电子传递链反应，建议选用无酚红培养基或设置空白对照扣除背景信号。

Q4：如何减少因加样误差导致的复孔间数据差异大（CV值高）？

A：解决方案：①使用多通道移液器加样，减少手动误差；②先配置含10% CCK-8的培养基，混匀后以换液形式加入，比逐孔加10 μL更均匀、误差更小；③接种细胞时确保细胞悬液充分混匀，无明显细胞团块；④加样时勿产生气泡——建议枪头斜贴培养板壁缓缓加入培养基中，避免插到液面下；⑤设立标准化接种密度：通过梯度稀释预实验确定最佳初始接种量，建议各孔间细胞数的CV值小于5%。

Q5：空白对照应该如何设置？

A：每种实验条件都需要设置空白对照：在不含细胞的培养基（100 μL/孔）中直接加入10 μL CCK-8溶液，培养相同时间后测定450 nm吸光度，用于扣除培养基颜色和CCK-8试剂本身的本底吸光度。对于加药实验（细胞毒性检测），还需考虑药物本身的吸收——额外设置不含细胞但含药物的空白对照孔，以扣除药物的背景干扰。

Q6：细胞在CCK-8检测后还能用于其他实验吗？

A：CCK-8溶液对细胞的毒性非常低，通常不会影响细胞存活。细胞在检测后理论上可继续进行其他实验。但是，为避免CCK-8溶液对后续检测的潜在影响，除非该细胞极其珍贵不易获得，否则不建议将孵育过的细胞用于其他关键实验。建议预留单独的细胞孔用于其他检测，或安排平行批次实验。

Q7：如果没有450 nm滤光片，可否使用其他波长？

A：可以。450 nm是CCK-8甲臜产物的最佳吸收波长，灵敏度最高。如果酶标仪没有450 nm滤光片，也可选择430-490 nm范围内的其他滤光片，但灵敏度会略有下降。对于高浓度处理后的显色较深的孔，还可参考使用600 nm或更高波长辅助测定以扣除背景。

使用CCK8测定法进行增殖评估。与M2巨噬细胞共培养后，卵巢癌症细胞（SKOV3、HEY、HO8910、OVCAR3）
的增殖率和活性增加，而M1共培养组的增殖率与活性降低。