本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗人 CXC 趋化因子配体 13（CXCL13）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入人 CXC 趋 化因子配体 13（CXCL13）校准品和待测样本，再加入另一株 HRP 标记的抗人CXC 趋化因子配体 13（CXCL13）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去 除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合 物。加底物 A 和 B，底物在 HRP 催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪 450nm 波长上测定吸光度（OD 值），吸光 度（OD 值）与待测样品中人 CXC 趋化因子配体 13（CXCL13）的浓度正相关。拟 合校准品曲线，可以计算出样本中人 CXC 趋化因子配体 13（CXCL13）的浓度。

操作程序
所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。
1、按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
3、设置标准品孔、0 值孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL，0 值孔加样本稀释液 50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本 50μL。
4、除空白孔外，标准品孔、0 值孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标 记的检测抗体 100μL。
5、用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光孵育 60min。
6、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 20S，甩 去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复 5 次。若使用自动洗板机，请按洗板机操 作程序进行洗板，添加浸泡 30s 的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加 底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
7、将底物 A 和 B 按 1:1 体积充分混合，所有孔中加入底物混合液 100μL。用 封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光孵育 15min。
8、所有孔加入终止液 50μL，在酶标仪450nm波长上读取各孔吸光度（OD 值）。

结果计算 
1、以标准品浓度做为横坐标（6 个标准品孔，加 1 个 0 值孔，共 7 个浓度 点），对应的吸光度（OD 值）作为纵坐标，利用计算机软件，采用四参数 Logistic 曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD 值），利用方程计算样品的浓度值。
2、如果样品被稀释，通过上述方法测的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品 的最终浓度。

典型数据
 以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

浓 度  (ng/ml)	20	10	5	2.5	1.25	0.625
OD 值	1.874	1.057	0.495	0.271	0.129	0.063

 

 

（示意图，仅供参考）

试剂盒性能指标

1、物理性能 
试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真 空包装，无破损漏气。

2、剂量反应曲线线性 
校准品剂量反应曲线相关系数 r 值，大于等于 0.9900。
 
3、精密度
批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块 内精度评估。
批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内 精度评估。
  

	批内变异系数			批间变异系数
样本	1	2	3	1	2	3
数量	20	20	20	20	20	20
平均值(ng/ml)	2	4.8	12.9	2.1	4.5	10.7
标准差	0.1	0.26	0.95	0.14	0.45	0.58
变异系数 (%)	5.1	5.4	7.4	6.6	9.9	5.4

 
4、灵敏度 
最低检出剂量小于 0.1 ng/ml(6 次独立实验的平均值)。 
10 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两倍 SD，计算最低可检测浓度。
 
5、回收率
 
分别往不同样本中添加已知的高、中、低浓度目的蛋白样品，进行五次在 同一个板块内回收率评估，回收率在 85%-115%之间。

样本类型	回收率范围（%）	平均回收率（%）
血清(n=5)	85-101	94
血浆(EDTA)(n=5)	82-95	89
细胞培养基(n=5)	86-96	92

  
6、特异性 
本试剂盒识别天然和重组人 CXC 趋化因子配体 13（CXCL13），与结构类似 物无交叉。

7、稀释线性 
将添加有高浓度人 CXC 趋化因子配体 13（CXCL13）的样本分别稀释 2 倍，
4 倍，8 倍，16 倍做回收实验，得出回收率范围及平均回收率。
 

		血清	血浆(EDTA)(n=5)	细胞培养基(n=5)
1:2	回收率范围(%)	83-92	89-98	87-102
1:4	回收率范围(%)	86-102	96-107	94-104
1:8	回收率范围(%)	84-101	92-104	98-111
1:16	回收率范围(%)	81-163	81-177	96-184

 
 
 
试剂盒说明
 
1、由于现有条件及科学技术水平尚不能对供货商提供的所有所有原料进行 全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。
2、最终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及实验环境密切 相关，请务必准备充足的标本备份。 
3、不同批次的同一产品可能会有少许差别，网站电子版说明书仅作参考。 
4、本试剂盒配套试剂必须配套使用，不能混用其他制造商的产品。只有严 格遵守本试剂盒的实验说明才会得到最佳的检测结果。 
5、用于制备试剂盒中抗体的免疫原通常为重组蛋白，但由于备重组蛋白所 选取的片段、表达系统、纯化方式等各有不同，所以我们无法保证该试剂盒可 用于其他公司重组蛋白的检测，通常我们也不建议使用试剂盒检测重组蛋白。 
6、该试剂盒仅供研究使用，如将其用于临床诊断或任何其他用途，我公司将不对因此产生的问题负责，亦不承担任何法律责任。

使用试剂盒警告
 
本试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免 接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。

ELISA实验问题解答
 

问题	可能原因	解决方案
标 准 曲线 差	试剂盒平衡时间不够	不低于 2 个小时的室温平衡
	吸取及洗涤不充分	充分的吸取及洗涤
	移液不精确	检查和校正移液器
精密度低	洗涤不充分	按说明书要求充分洗涤和浸泡
	混匀不充分和吸取试剂不足	充分混匀和吸取试剂
	重复利用吸头、容器和覆膜	使用加样器要更换新的吸头、使用新的封板模
	加样不精确	检查和校正移液器
O.D 值低	每孔加的试剂量不精确	校正移液器，精确加入试剂
	温育时间不正确	保证充足的温育时间
	温育温度不正确	试剂要平衡至室温并保证准确的温育温度
	酶标记物或底物失效	通过混合酶标记物和底物，颜色迅速显现来检查
	没有加入终止液	按照说明书实验操作步骤加入终止液
	超出读数时间读数	在说明书推荐的读数时间内读数
样本值	不正确的样本储存方式	正确储存样本，使用新鲜样本进行实验
	不正确的样本收集和处理方法	采取正确的样本收集和处理方法
	待测物质在样本中含量低	使用新鲜样本，重复实验

 

...

...